An interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism

不依赖于干扰素的lncRNA通过调节细胞代谢来促进病毒复制

期刊：Science；影响因子：41.058

发表单位：第二军医大学

导读

   病毒感染宿主细胞会调节宿主代谢网络以创造利于病毒生长和复制的条件。这种调控可以通过IFN-1/IRF3途径进行，在这个过程中lncRNA是怎样参与的，了解很少。本研究通过高通量筛选发现lncRNA-ACOD1表达量异常，敲低时病毒生存和繁殖能力下降，临近基因分析未找到cis调控基因。ChIRP实验获取结合蛋白，并做质谱分析发现，lncRNA-ACOD1可以与代谢酶GOT2（GOT2表达水平没有变化）结合进而调控代谢网络，促进病毒增殖。

1 摘要

   病毒调节宿主代谢网络以改善其生存条件。然而，对病毒感染后宿主产生反应的分子有哪些，是如何调节这种代谢变化的，对于理解病毒感染是必不可少的。在这里，我们鉴定了由多种病毒诱导细胞产生的lncRNA，不是由I型干扰素（IFN-1）诱导的，该lncRNA促进小鼠和人细胞中的病毒复制。lncRNA-ACOD1敲低通过IFN-1/IRF3非依赖性途径显著减弱病毒感染。细胞质lncRNA-ACOD1直接结合基质壁附近的代谢酶谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT2），增强其催化活性。重组GOT2蛋白及其代谢物可以在lncRNA-ACOD1敲低后挽救病毒复制并增加致死率。这项工作揭示了病毒诱导的lncRNA介导的病毒感染促进代谢的反馈方式，为开发广谱抗病毒疗法提供潜在目标。

2 研究背景

   代谢是所有生物过程的能量和材料的来源。繁殖型病毒感染需要改变宿主细胞代谢网络以获得病毒生命周期的材料。正链RNA病毒和包膜病毒改变脂质代谢增强复制能力，丙型肝炎病毒（HCV）在肝细胞中引发类似谷氨酰胺的代谢。尽管一些宿主和病毒编码的microRNA已被证明可部分介导这些代谢途径的改变，但所涉及的分子机制仍然了解很少，特别是病毒如何靶向和调节宿主代谢网络以进行复制并逃避宿主防御。在哺乳动物基因组中已经鉴定了数以千计的长非编码RNA（lncRNA），其中只研究了少数，但越来越多地lncRNA在不同的过程和疾病的功能得以鉴定，包括感染，先天性和适应性免疫。干扰素，尤其是I型干扰素（IFN-I），是通过激活干扰素刺激的基因（ISG）来控制病毒感染的重要细胞因子。尽管已经报道了一些宿主lncRNA来调节ISG的表达或受病毒感染中的干扰调节，但我们对感染细胞中lncRNA功能的了解仍然非常有限，特别是关于病毒劫持宿主主宰复制的机制。目前，报道的lncRNA功能模式主要集中在调节细胞核中基因表达和影响细胞质中信号转导或吸附microRNA。然而，lncRNAs其他作用方式仍然存在。是否存在其他未知的lncRNA调控机制需要进一步探索。

3 结果

   为了研究lncRNAs在病毒感染中的作用以及与IFN-I系统的关系，我们分析了野生型（WT）和IFN-1受体缺陷型（Ifnar^{- /-}）巨噬细胞中在有或没有水疱性口炎病毒（VSV）感染时lncRNA表达。有趣的是，我们鉴定了一组病毒诱导的IFN-I非依赖性lncRNA：病毒感染诱导其表达而不在意IFN-1受体缺陷，而单独的IFN-I刺激也不能诱导它们的表达（图S1A）。通过对这些IFN-I非依赖性lncRNA进行RNA干扰（RNAi）介导的功能实验，我们发现巨噬细胞中的病毒滴度在基因间lncRNA的敲低时显著下调（Gene Symbol LOC102637961）（图S1B），其最近的编码基因是ACOD1，下文称为lncRNA-ACOD1。我们证实lncRNA-ACOD1可以被独立于IFN-1的许多类型的病毒刺激（图1A），与IFN-1依赖性lncRNA LOC625033（图S1C）相反。此外，在检测到的大多数细胞和器官中，lncRNA-ACOD1由病毒感染诱导（图1，B和C）。通过Northern印迹确认具有poly（A）尾的lncRNA-ACOD1表达（图1D）。cDNA末端的快速扩增（RACE）和RNA测序数据显示它具有三个外显子和两个转录物变体（2330和2259个核苷酸）（图S2，A至C）。lncRNA-ACOD1具有中等表达水平，每个细胞约100个转录本拷贝（图S2D），并且我们的核糖体分析数据显示它具有非常低的核糖体占据（图1E），表明lncRNA-ACOD1缺乏编码潜力。

   转录因子IRF3在IFN-I的产生和病毒感染功能中起着至关重要的作用。使用Irf3^-/-或Ifnar1^-/-细胞和小鼠，我们发现lncRNA-ACOD1表达独立于IRF3/IFN-1信号传导（图S3）。然而，我们的药理学抑制剂测定显示，lncRNA-ACOD1表达很大程度上依赖于核因子-κB（NF-κB）（图S4A），这是一种参与多种细胞过程的转录因子复合物，包括细胞代谢和炎症。因此，我们在lncRNA-ACOD1启动子序列中鉴定了NF-κB复合物RelA的三个结合位点。然后将具有或不具有RelA motif突变的启动子区域克隆到萤火虫荧光素酶编码区的上游（图S4，B和C，左）。荧光素酶表达仅在存在野生型RelA motif时高，并且可以通过RelA过表达进一步增强（图S4，B和C，右），表明NF-κB而非IRF3/IFN-I参与诱导lncRNA-ACOD1。

   接下来，我们研究了lncRNA-ACOD1在病毒感染中的作用。我们发现敲低lncRNA-ACOD1（图2A）显著降低了巨噬细胞中的VSV含量（图2，B和C）。病毒含量的减少不是由于宿主先天免疫反应增强，因为IFN-1和IL6的产生和有效基因表达水平也因lncRNA-ACOD1的敲低而降低（图S5）。在另外两种病毒感染，DNA病毒单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和痘苗病毒（VACV）（图S6）中也观察到类似的病毒含量和先天反应的减少，表明lncRNA-ACOD1促进了病毒感染。我们在病毒进入时进行瞬时感染测定，并显示lncRNA-ACOD1对病毒进入没有影响（图S7A）。然后我们利用紫外线照射VSV（UV-VSV），它可以感染细胞但不会增殖，poly (I：C) 是病毒RNA的模拟刺激，刺激细胞。我们发现lncRNA-ACOD1对UV-VSV和poly（I：C）反应没有影响（图S7，B和C），表明lncRNA-ACOD1在宿主细胞中的病毒复制阶段起作用。此外，我们利用CRISPR-Cas9敲除巨噬细胞系RAW264.7中的lncRNA-ACOD1并获得了类似的结果（图S8），进一步证实了lncRNA-ACOD1对病毒复制至关重要。

   为了探索lncRNA-ACOD1在体内的作用，我们构建了lncRNA-ACOD1敲除小鼠（图S9，A和B）。我们发现体内VSV复制在lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中显著降低（图2，D和E），同时病理改变减弱（图2F和图9C）并且免疫先天反应减弱（图9，D和E）。此外，所有lncRNA-ACOD1缺陷小鼠在用致死剂量的VSV感染攻击时存活，而大多数同胞对照死亡（图2G）。我们还使用病毒性动脉内感染模型来测试体内lncRNA-ACOD1功能并观察到类似的结果（图S10）。在人类中，lncRNA-ACOD1同源转录本也因甲型流感/PR/8/34病毒（PR8）对病毒感染的反应而上调，其通过RNAi敲低导致A549人肺泡基底上皮细胞的病毒含量降低（图S11），表明lncRNA-ACOD1在促进病毒复制中的功能至少在人和小鼠中是保守的。

   由于lncRNA-ACOD1表达独立于IFN-I/IRF3，我们分析了lncRNA-ACOD1功能是否也与体内IFN-I/IRF3无关。因此，我们通过用Ifnar1^-/-小鼠或Irf3^-/-小鼠繁殖lncRNA-ACOD1缺陷小鼠来产生双敲除小鼠。我们发现，在没有IFN-1信号传导的情况下，lncRNA-ACOD1的缺乏导致VSV增殖的显著抑制以及减轻的免疫应答（图2，H和I，以及图S12，A和B）和显著降低致死率（图2，J和K）。因此，我们提出lncRNA-ACOD1可能通过新的机制而不是经典的IRF3/ IFN-I途径促进病毒复制。

   为了试探lncRNA-ACOD1是否通过细胞凋亡和自噬发挥作用，据报道它们参与了病毒清除，我们用流式细胞仪和免疫印迹法检测了lncRNA-ACOD1的作用，发现宿主细胞凋亡和自噬没有受lncRNA-ACOD1的影响（图S13）。然后我们试探了lncRNA-ACOD1是否以顺式作用，影响附近的基因表达（图S14A）。我们发现lncRNA-ACOD1的敲低或缺乏不会影响附近基因的表达（图S14，B和C），反之亦然（图S14D）。我们接下来检查细胞中lncRNA-ACOD1的位置。对核/细胞质组分进行RNA荧光原位杂交（FISH）和反转录RT-PCR（图S15），表明它位于细胞质中，表明它可能与细胞质分子或蛋白质相互作用。

   为了获得lncRNA-ACOD1机制的线索，我们进行了微阵列转录组分析，发现lncRNA-ACOD1缺陷导致许多代谢相关基因的表达水平发生变化（此处做了lncRNA-ACOD1敲低，然后高通量筛选寻找靶基因）（图S16A）。途径富集分析显示代谢途径是受lncRNA-ACOD1缺失影响的最重要途径（图S16，B和C），表明lncRNA-ACOD1在病毒感染期间在代谢调节中的可能作用。因此，我们使用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）进行了全代谢组学调查，结果显示病毒感染导致WT细胞的大量代谢变化，这被lncRNA-ACOD1缺乏所消除，如图所示。鉴定中间体的负离子/正离子的簇图（图S17）。

   为了在体内搜索lncRNA-ACOD1相互作用分子，我们使用修饰的ChIRP纯化内源性lncRNA-ACOD1复合物。在确认选择性地检测到lncRNA-ACOD1而不是U6 RNA和ACTB mRNA后（图S18），通过凝胶电泳分离lncRNA-ACOD1相关蛋白并通过质谱（MS）鉴定。GOT2是一种参与许多过程的关键代谢酶，包括氨基酸代谢，长链脂肪酸摄取和三羧酸循环，被鉴定为lncRNA-ACOD1结合蛋白，经独立免疫印迹法进一步证实（图3A）。在天然条件下使用GOT2特异性抗体（Native RIP）和紫外交联条件（UV-CLIP）的RNA免疫沉淀（RIP）测定均显示lncRNA-ACOD1，但不是其他测试的RNA，在GOT2抗体中高度富集的复合物与免疫球蛋白G（IgG）检测的样品相比，验证了小鼠和人的相互作用的特异性（图3B和图S19）。而我们的亚细胞组分 - 比如进一步显示它们的相互作用发生在细胞质而不是线粒体中（图S20）。 lncRNA-ACOD1和GOT2的解离常数为1.51±0.05×10-8M（图S21）。我们发现lncRNA-ACOD1对GOT2表达水平没有影响（图S22）。

   然后我们检查了lncRNA-ACOD1是否通过GOT2起作用。排除了对细胞活力或其他重要过程的可能作用后（图S23），我们发现GOT2敲除显著降低了VSV复制（图3，C和D）和免疫应答（图S24，A和B），lncRNA-ACOD1在病毒感染中表达量下降。并且我们发现lncRNA-ACOD1过表达促进对照细胞中的病毒复制和免疫应答，而对GOT2敲低细胞没有影响（图3E和图S2和S4C），表明GOT2的敲低阻断了lncRNA-ACOD1活性。此外，用重组活性GOT2补充细胞挽救了lncRNA-ACOD1敲低（图3F）和GOT2敲低（图3G）的作用以促进病毒复制。基于这些数据，我们提出病毒诱导的lncRNA-ACOD1通过直接结合代谢酶GOT2促进病毒复制。

   通过适应的eCLIP印迹GOT2复合物的RNA测序揭示了与GOT2相互作用的lncRNA-ACOD1 5'端的区段（核苷酸165至390）（图4A）。然后使用全长或5'结合位点缺失的lncRNA-ACOD1来处理lncRNA-ACOD1敲除巨噬细胞，我们发现GOT2结合位点依赖性拯救病毒复制（图S25）。GOT2蛋白质结构高度保守，具有大结构域，小结构域和氨基末端尾部（图4B上部）。两个GOT2蛋白质分子形成生物同源二聚体，两个同源二聚体构建不对称单元，催化代谢物之间的可逆转氨作用，如草酰乙酸和L-谷氨酸转化为L-天冬氨酸和α-酮戊二酸。为了解lncRNA-ACOD1如何影响GOT2功能，我们通过在蛋白酶消化的lncRNA-ACOD1复合物中结合肽MS鉴定研究了GOT2的哪一部分与lncRNA-ACOD1相互作用，我们发现了15个残基的肽（残基54-68）来自GOT2的小结构域作为lncRNA-ACOD1的结合位点（图4B，mid-dle），其在脊椎动物中相对高度保守（图4B，下图）。使用完整或片段缺失的GOT2，我们的RIP测定证实这15个残基区域对于lncRNA-ACOD1结合是关键的（图4C）。

   在结构上，结合肽在空间上接近底物位点（Gly65残基和之间的4.2Å）（图S26），表明lncRNA-ACOD1可能影响GOT2的酶活性。为了验证这一假设，我们使用纯化的GOT2蛋白和T7转录的lncRNA，在体外进行酶促反应的动力学测定。通过HPLC-MS检测L-天冬氨酸输出的速率，我们发现lncRNA-ACOD1增强了GOT2的催化活性，这取决于其5'结合位点，如图所示的kcat值（图4D）。此外，我们还尝试检查lncRNA-ACOD1对体内GOT2活性的影响。我们发现GOT2代谢物L-天冬氨酸和α-酮戊二酸在代谢物靶向LC/MS检测中的lncRNA-ACOD1缺陷小鼠（图4E）以及我们的代谢组学数据（表S1）中显著降低，表明GOT2体内lncRNA-ACOD1缺乏会抑制酶活性。然后，我们检查了GOT2代谢物是否可以挽救lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中抑制的病毒复制。我们在VSV攻击前用L-天冬氨酸或α-酮戊二酸腹膜内补充到lncRNA-ACOD1^-/-小鼠，发现它们促进体内病毒复制并增加致死率（图4，F和G）。总之，我们的研究结果表明，病毒感染诱导的lncRNA-ACOD1反馈通过促进GOT2催化活性及其代谢产物促进病毒复制。

   虽然在系统方法中已将代谢酶鉴定为潜在的RNA结合蛋白，但对其功能相关性和分子机制知之甚少。我们发现氨基转移酶GOT2与病毒诱导的lncRNA-ACOD1在空间上最接近底物生态位的最保守的15-残基部分相互作用，通过模拟GOT2活性及其代谢产物，lncRNA-ACOD1促进病毒复制和感染。与报告的lncRNA机制模型相比，我们通过NF-κB而非IFN-I途径鉴定了病毒感染诱导的lncRNA，其通过代谢酶结合机制起作用以促进病毒感染。这代表了病毒利用宿主代谢网络进行生存的新方法，提供了对代谢调节和病毒感染的洞察，这可能与涉及代谢功能障碍和病毒感染的临床疾病有关，其中lncRNA-ACOD1可能是干预的有用目标。 

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