Long noncoding RNA EGFR-AS1 mediates epidermal growth factor receptor addiction and modulates treatment response in squamous cell carcinoma

长链非编码RNA EGFR-AS1介导表皮生长因子受体敏感度并调节鳞状细胞癌的治疗响应

期刊：Nature medicine；影响因子：32.621

发表单位：新加坡国家癌症中心癌症治疗研究实验室

导读

通过靶向EGFR肿瘤药物治疗鳞状细胞癌是一个有效的办法，但仍有很大一部分患者对药物的敏感程度不高，本研究发现EGFR基因同义SNP突变影响着药物敏感性，同义SNP可以调节lncRNA EGFR-AS1的表达，EGFR-AS1影响EGFR同基因不同转录本D与A表达比率，同基因不同转录本介导配体驱动的EGFR敏感度，进而引起对药物反应的差异。

1摘要

靶向EGFR是治疗鳞状细胞癌（SCC）的有效方法，尽管尚无确定的生物标志物用于预测效果。我们已经确定EGFR的同义突变，c.2361G> A（编码p.Gln787Gln），两名头颈部SCC（HNSCC）患者是吉非替尼的特殊响应者，我们在患者来源的培养物中显示与G/A和G/G基因型相比，基因型A/A与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的更高敏感性相关。值得注意的是，单拷贝G> A等位基因模型中的核苷酸编辑由于EGFR-AS1长非编码RNA（lncRNA）的表达量降低而使灵敏度提高了70倍。在适当的背景下，灵敏度可以通过体外和体内EGFR-AS1敲低重现，而过表达足以诱导对TKI的抗性。EGFR-AS1水平降低使剪接转向EGFR同基因转录本D，导致配体介导的通路激活。在涉及患者和患者衍生的异种移植物（PDX）模型的共同临床试验中，肿瘤缩小在EGFR-Q787Q的A/A基因型，EGFR-AS1的低表达和EGFR同基因转录本D的高表达的背景下最明显。我们的研究揭示了“同义”突变如何影响lncRNA的水平，导致非典型的EGFR敏感度，并描绘了一种新的用于响应EGFR TKI预测生物标志物。

2 研究背景

表皮生长因子受体（EGFR）-途径-导向的治疗学已证实在HNSCCs中的临床效果，其中已观察到治疗结果的位点特异性差异。口腔鳞状细胞癌（OSCC）是HNSCC的一个亚组，具有不断变化的分子和统计学特征，包括人乳头瘤病毒（HPV）阳性率低和不吸烟者比例增加。尽管多方法治疗已经有了实质性的改进，但接受此类治疗的患者中只有50％得到治愈。迄今为止，铂类化疗治疗后转移复发的患者治疗选择有限，总生存时间中值为6-9个月。尽管无可辩驳的证据表明一部分HNSCC依赖于EGFR信号传导，但通过单克隆抗体和/或TKIs治疗仅取得了中等成功。在转移性环境中，西妥昔单抗单药治疗的响应率为13％; EGFR TKIs在多个2期试验中的疗效差异很大，响应率为1.8-20％。

靶向治疗的成功取决于高精度生物标志物预测的使用。HNSCC中的基于群组的测序研究和OSCC中的亚群分析未能证明在EGFR或其他候选生物标记的外显子18-21中激活突变的预测潜力（例如，EGFR扩增）对抗EGFR疗法的反应，提示一部分肿瘤通过未知的非基因组机制仍然依赖于EGFR信号转导。在一项完成的2期试验中，我们检测了吉非替尼联合放化疗治疗不能切除的OSCC的作用，我们记录了在单药治疗的最初4周内接受吉非替尼治疗的两名患者的显著反应。在这两种情况下，靶向EGFR测序均未显示“激活”突变或扩增。然而，在这两位患者中，我们在EGFR外显子20的编码位置2361（A/A而不是野生型G/G）中鉴定出同义纯合单核苷酸变体。该变体先前已在HNSCC细胞系中描述，其中在该位置具有异源G/A与G/G（野生型）基因型的细胞中观察到增加的吉非替尼敏感性。

基于观察到EGFR-Q787Q（SNP ID，rs10251977; c.2361G> A）与gefit-inib的临床反应相关，我们首次根据我们的知识描述EGFR中的沉默SNP如何赋予对EGFR TKI的敏感性。这种敏感性源于SNP调节lncRNA EGFR-AS1转录的作用，这决定了EGFR同基因转录本的表达比例，而EGFR同基因转录本又反过来介导配体驱动的EGFR敏感度。

3 结果

1 患者来源的口腔鳞状细胞癌原代培养物中EGFR外显子20的沉默多态性介导的TKIs的差异敏感性

先前在我们实验室建立的6个患者来源的原代培养细胞系测试了对EGFR抑制剂吉非替尼和厄洛替尼的敏感性（图1a和补充表1）。如图所示，六种原代细胞系中有四种对EGFR抑制不敏感，而NCC-HN19和NCC-HN64在治疗范围内始终表现出半数最大抑制浓度（IC₅₀）值（吉非替尼和厄洛替尼分别是0.07和0.26M）。靶向重测序未检测到致敏EGFR突变或揭示药物敏感性与EGFR拷贝数之间的任何相关性（补充图1a）。相反，在上述2期试验（SNP ID，rs10251977; c.2361G> A; p.Gln787Gln）中鉴定的相同同义SNP中，两条敏感品系对于A等位基因是纯合的，而对于该SNP，纯合野生型（G/G）或杂合（G/A）（补充图1b）抗性增加。从15分钟到48小时的时程实验确定16小时是比较细胞系之间的途径信号传导的最佳时间点（数据未显示）。与观察到的表型一致，吉非替尼敏感系NCC-HN19和NCC-HN64（A/A基因型）的Western印迹一致显示EGFR，AKT，细胞外信号调节激酶（ERK）和核糖体蛋白的磷酸化水平降低，用治疗剂量的吉非替尼和厄洛替尼治疗后的S6（S6）（图1b和补充图1c）。相比之下，具有G/G基因型（NCC-HN1和NCC-HN43）的细胞系需要更高的药物剂量来降低磷酸化AKT和磷酸化S6的水平，并且治疗仅对ERK磷酸化水平有一定的影响。

2 单核苷酸编辑逆转了对同基因细胞系中EGFR TKI的抗性

我们使用腺相关病毒（AAV）靶向系统通过同源重组产生单核苷酸改变的同基因'敲入'模型（补充图1d，e）。引入单拷贝的SNP（杂合子）足以将对EGFR TKI（NCC-HN1）的抗性转化为同基因背景上的敏感性（图1c）。表达的EGFR cDNA的Sanger测序证实A基因型在成功靶向的克隆中表达（G/A^AAV：NCC-HN1克隆16（CL16），CL63和CL19），与载体整合的阴性对照相比较（G/G^AAV：NCC-HN1 CL12，CL76和CL77）。 G/A^AAV克隆（CL16，CL19和CL63）的IC₅₀值范围为0.1-0.3M，而未编辑的G/G^AAV对照（CL12）的值范围为6.4-7.2M（NCC-HN1亲本细胞系IC₅₀范围为7-11μM的）（图1c），用TKI处理后EGFR下游途径的调节一致（图1d和补充图1f）。基因型之间对EGFR TKI具有相同的差异敏感性模式，但是这种模式在用西妥昔单抗治疗后不明显（图1e和补充图1g），针对EGFR的单克隆抗体，目前已在临床上批准用于HNSCC治疗。该结果突出了如何在针对EGFR途径的不同药物类别中观察到差异敏感性。

3 长的编码RNA EGFR-AS1驱动体外和体内EGFR敏感度

数据分析显示没有可能影响EGFR mRNA转录或翻译的潜在microRNA（miRNA）靶向位点（数据未显示）。然而，我们发现该SNP位于编码lncRNA EGFR-AS1的转录区域内（图2a）。实时RT-PCR分析显示EGFR-AS1 lncRNA的水平在具有G/G基因型（NCC-HN1和NCC-HN43）的EGFR-TKI抗性系中显著高于具有A/A基因型（NCC-HN19和NCC-HN64）EGFR-TKI敏感系中的水平（图2b）。类似地，与对照G/G^AAV克隆相比，NCC-HN1的同基因G/A^AAV克隆具有较低的EGFR-AS1 lncRNA水平。使用专门设计用于检测EGFR-AS1的NanoString方法进一步验证了这些结果（补充图2a）。使用放线菌素D来阻断转录，我们接下来证明EGFR-AS1 lncRNA在具有G/G基因型的品系中比在具有A/A基因型的品系中更稳定，并且这一发现在编辑的同基因NCC- HN1克隆中重现（图2c）。我们接下来检查了55种头颈部癌症的癌症基因组图谱（TCGA）RNA-seq数据。在这些情况下，发现EGFR-AS1水平在肿瘤组织中高于在匹配的正常对照中（补充图2b）。此外，较高水平的lncRNA似乎与G/G基因型相关，尽管在样本数量有限的情况下，这种相关性没有达到统计学意义（P = 0.1，Wilcoxon秩和检验，单尾）。使用两种不同的小干扰RNA（siRNAs）靶向敲低EGFR-AS1（补充图2c）足以显著增加G/G基因型对吉非替尼的细胞系的敏感性，平均IC₅₀降低NCC-HN1的值为8.9μM至2.6-3.3μM，NCC-HN43的值为9.6μM至0.1-1.2μM，用于两次独立的敲低测定（图2d）。相应的蛋白质印迹显示用治疗剂量的TKI治疗后EGFR下游信号传导减少（补充图2d）。相反，野生型EGFR-AS1 lncRNA的异常表达能够显著提高先前敏感的NCC-HN19系中IC₅₀值从0.098μM到0.7-1.4μM，从0.12μM到5.0-5.6μM。CC-HN64分别用于吉非替尼和厄洛替尼，证实了lncRNA在调节对TKI耐药中的作用（图2e和补充图2e）。

为了测试EGFR-AS1是否是EGFR敏感度的真正驱动因素，我们研究了表达高水平EGFR-AS1的G/A或G/G基因型的肿瘤是否依赖于这种lncRNA，通过使用PDX系统在体内进行敲低。设计了一组针对EGFR-AS1的locked nucleic acids（LNA），并且使用通过体外筛选进行有效敲低的最有效候选物。随后将体内靶向LNA的EGFR-AS1和对照非靶向LNA注射（每周剂量，5mg/kg体重）到含有PDX的NOD-scid-γ（NSG）小鼠的尾静脉中。表达EGFR-Q787Q的肿瘤（HN124）具有G/A基因型和高EGFR-AS1水平。在仅LNA处理1周后，在每天的吉非替尼（25mg/kg体重）上开始小鼠用于实验的其余部分。与非靶向对照治疗相比，在用EGFR-AS1靶向LNA治疗后1周，在PDX中观察到EGFR-AS1水平的成功敲低（补充图2f）。值得注意的是，与对照相比，在体内用LNA靶向EGFR-AS1足以诱导持续的肿瘤消退（图2f），其中对照LNA或吉非替尼治疗都没有显示出任何效果。我们用不同的PDX（HN159：G/G基因型，高EGFR-AS1水平）重复实验（图2f），用EGFR-AS1靶向LNA（成功敲低）再次治疗小鼠再次导致肿瘤持续消退与用对照处理的小鼠相比；这一发现符合EGFR-AS1 lncRNA介导EGFR敏感度的观点。

4 通过EGFR同基因转录本差异表达介导EGFR TKI的敏感性

我们继续检查EGFR-AS1 lncRNA对表达四种已知EGFR同基因转录本（A-D）的水平的影响（补充图3a）。实时PCR分析显示，EGFR的A和D同基因转录本的表达水平存在一致差异，导致A/A基因型（NCC）中同基因转录本D与同基因转录本A转录水平的比例更高。NCC-HN19和NCC-HN64与具有G/G基因型的细胞系（NCC-HN1和NCC-HN43）相比较；在编辑的G/AAAV克隆中结果相似（图3a）。这一发现可以使用针对EGFR的N末端的抗体在蛋白质印迹中重现（补充图3b）。Northern印迹证实，与A/A基因型和基因型编辑的G/A^AAV克隆相比，具有G/G基因型的品系的同基因转录本D水平增加（补充图3c）。此外，使用两种不同的siRNA靶向敲低EGFR-AS1 lncRNA足以增加同基因转录本D：同基因转录本A的比例，特别是在具有G/G基因型（NCC-HN1和NCC-HN43）的细胞中，其中主要作用是同基因转录本D的转录水平增加，随之增加对TKI的敏感性（图3b）。有趣的是，在上述体内实验中，在具有高水平EGFR-AS1表达（HN124和HN159）的PDX中显示出增强的治疗功效，我们还观察到EGFR-AS1敲低后收集的肿瘤中同基因转录本D水平的增加（图3c）。相反，EGFR-AS1的过表达导致'低表达'细胞系模型NCC-HN19和NCC-HN64的相反作用，其中观察到同基因转录本D水平显著降低和同基因转录本D：同基因转录本A比例降低（补充）图3d）。TCGA中转录本表达量分析类似地显示在具有最低EGFR-AS1水平的三种肿瘤中同基因转录本D：异构体A比率增加（补充图3e），尽管TCGA分析存在重大警告，包括该库中的所有肿瘤都表现出EGFR扩增，并且可获得的RNA-seq数据的读取深度可能不足以确定低丰度转录本如lncRNA和剪接变体。总之，这些数据揭示了EGFR-AS1在调节EGFR同基因转录本的差异表达中的作用。

考虑到EGFR-AS1对异构体D的主要影响，我们研究操纵同基因转录本D表达是否会改变对EGFR TKI的敏感性。使用EGFR外显子15B的独特序列（补充图3a）设计了特异性靶向同基因转录本D的短发夹RNA（shRNA）。NCC-HN19，NCC-HN64，NCC-HN1和NCC-HN43细胞系的稳定转染导致靶向同基因转录本D而非同基因转录本A的特异性（补充图3f）。先前对吉非替尼敏感的模型，NCC-HN19和NCC-HN64（均具有A/A基因型）在同基因转录本D敲低后呈现更强的抗性（图3d），并且对于具有这些模型的细胞没有显著影响。类似地，编辑的G/A^AAV克隆中的靶向同基因转录本D导致TKI敏感性降低，而对阴性对照没有影响。相对于非靶向对照，同基因转录本D的表达降低也减弱了吉非替尼和厄洛替尼对具有A/A基因型的细胞系中下游EGFR途径活性的影响（图3e和补充图3g）。值得注意的是，EGFR-AS1敲低对促进吉非替尼敏感性的作用在具有G/G基因型的细胞同时敲低EGFR同基因转录本D被消除（图3f）。为了确定对EGFR TKIs的敏感性是否是配体依赖性，将细胞系在含有血清，无血清培养基，补充有表皮生长因子（EGF）的无血清培养基和含有西妥昔单抗或尼妥珠单抗的无血清培养基的正常培养基中培养。阻断配体结合。然后用吉非替尼和异丙肾上腺素处理细胞。与无血清条件相比，具有A/A基因型和基因型转换的G/A^AAV克隆的细胞中两种药物的IC₅₀值在富含血清和EGF的培养基中显著降低（图3g和补充图3h）。值得注意的是，在无血清和EGF富集条件下，EGFR阻断（临床中使用两种不同的抗EGFR单克隆抗体）能够提高吉非替尼的IC₅₀水平，证实对EGFR TKI敏感性的调节确实是配体依赖性的，但也暗示了自分泌和/或旁分泌效应。

总之，我们已经阐明了EGFR敏感度的一种新的非经典机制，其中EGFR-AS1 lncRNA的表达增加导致EGFR同基因转录本A和D的差异剪接以及随后的EGFR途径的配体依赖性激活。

5 EGFR-AS1 lncRNA和EGFR同基因转录本D：同基因转录本A比率代表对EGFR TKI的响应的新生物标志物

我们扩展了我们的机制研究结果，以确定我们收集的8种患者来源的细胞系中的生物标志物，这些细胞系用一系列EGFR抑制剂治疗。为了筛选这些生物标志物，我们开发了一种RT-PCR检测方法，用于确定转录水平以及患者来源的细胞系和临床样本中EGFR同基因转录本A和D的相对水平，以及基于组织的检测使用RNA原位杂交（RNAscope）。首先，我们发现EGFR-AS1水平与患者来源细胞系中IC₅₀水平呈正相关；最强的相关性是吉非替尼（r2 = 0.86; P = 0.001）和厄洛替尼（r2 = 0.84; P = 0.0039）（基于Pearson相关系数），并且A/A和G/G基因型之间存在明显的差异（图4a）。接下来，我们使用RT-PCR对细胞系中的EGFR-AS1水平与EGFR同基因转录本A和D的相对水平相关联，并且我们还使用RNAscope检查了EGFR-AS1水平与组织中原位RNA表达的关系（半定量分级为1+或0）（图4b和补充图4a）。可能的情况下，使用专门设计用于检测EGFR-AS1 lncRNA的NanoString实验确认EGFR-AS1水平（补充图4b）。在具有A/A基因型的细胞中，EGFR-AS1没有检测到，同基因转录本D：同基因转录本A比率增加。相反，在具有G/A或G/G基因型的细胞中，EGFR-AS1水平高，具有低同基因转录本D：同基因转录本A比率（图4c）。回顾分析两名特殊响应者（患者P8526（OSCC）和患者P4205（口咽SCC））用吉非替尼治疗，接着吉非替尼联合放疗，显示其具有EGFR-Q787Q的A/A基因型，并且检测不到或低EGFR-AS1水平（通过RNAscope和NanoString分别）与对照组相比，对相同的治疗方案没有反应（患者P8241和患者P3911，均为OSCC）（图4c和补充图4b-d）。通过新加坡临床试验（IMPACT-SG）计划（NCT02806388；在补充表2中总结的所有患者细节）前瞻性地分析了另外7名患者，并且发现其具有A/A基因型；在所有具有足够组织进行分析的患者中，RNAscope和/或实时RT-PCR/NanoString分析显示EGFR-AS1分别检测不到或低水平。所有这些患者都表现出对EGFR TKI治疗的临床，放射学和/或生化反应（图4c和补充图4e-j）。

对于该组中的三名患者，衍生出离体模型（来自患者来源的细胞培养物或异种移植物）并用于进一步研究A/A基因型EGFR-Q787Q，EGFR-AS1水平和EGFR同基因转录本D：同基因转录本A比率在对TKI反应的生物标志物。我们验证了EGFR-Q787Q A/A基因型的存在，并在所有三名患者中通过实时PCR确认了低水平的EGFR-AS1和高EGFR同基因转录本D：同基因转录本A比例（图4c）。模型推导如下：HN137-PDX源自原发性肿瘤组织和转移灶，HN177-PDX源自转移灶，HN148-原代细胞培养物源自原发性肿瘤组织。对于HN137和HN177，扩增PDX并分别用吉非替尼和厄洛替尼治疗小鼠。与未治疗的对照相比，当用EGFR TKI治疗时，两种PDX肿瘤均显示出显著的肿瘤消退（图4d，e）。根据这些结果，HN137和HN177来源的患者分别开始每日250mg剂量的吉非替尼和150mg剂量的厄洛替尼治疗。放射学评估显示治疗6周后转移性病变和血清肿瘤标志物（H1917的CA19-9）消退（图4d，e），3个月后持续应答（补充图4i）。对于HN148，源自患者的培养物在体外对EGFR TKI表现出很好的反应（图4a）。因此，当患者出现无法切除的局部复发时，他接受吉非替尼单药治疗，并在治疗2个月后表现出显著的肿瘤缩小（补充图4j）。

总之，我们的临床和患者衍生模型突出了不同生物标志物维度之间复杂的相互作用，并提供了我们所知的生物标志物的第一个例子之一 -包括同义基因组改变，lncRNA的表达水平和可变剪接的EGFR变体。有助于准确预测EGFR TKI的临床反应。

4 讨论

尽管美国食品和药物管理局（FDA）批准了针对HNSCC的EGFR靶向疗法，但尚未建立针对这些癌症的强有力的预测性标志物。在这里，我们报道了由lncRNA EGFR-AS1介导的EGFR敏感度的新机制，并显示了同义单核苷酸变体如何通过调节lncRNA稳定性以及因此相关的lncRNA的表达水平对药物敏感性产生深远影响。随后EGFR同基因转录本D：同基因转录本A比率的增加导致配体驱动的EGFR途径激活。这些机制研究的结果得到SCC患者（6例OSCC，1例鼻腔，1例食管和1例肺癌）（n = 9）结果的支持，所有患者均表现出对EGFR TKI的临床相关抗肿瘤反应EGFR-Q787Q的A/A基因型，EGFR-AS1水平低或检测不到。癌症中最具预测性的标志物是基于基因组学的，并且主要局限于改变mRNA和蛋白质结构和功能的非同义突变。据我们所知这是第一次报道，描述了非同义突变的SNP如何降低lncRNA的水平并调节对EGFR抑制剂的敏感性。本研究，定义了一个全面的生物标志物套装，最终需要在更大的患者群体中进一步验证，以精确预测哪些患者可能对EGFR TKIs有反应，从而最终导致EGFR激活。

lncRNAs的转录本范围为200 nt至100 kb，分布于整个基因组中。虽然它们具有很少或没有蛋白质编码能力，但它们具有多种功能，包括转录调节，通过染色体修饰的表观遗传调节和转录后调节。这些功能中的一些涉及与DNA，前mRNA和成熟mRNA的直接（基于同源性）结合。据报道，lncRNA的三维结构构象在决定这些分子的稳定性和扩展其广泛的功能方面起着重要作用。 EGFR-AS1是2.8kb的转录物，对应于EGFR基因的内含子和外显子20（图2a）。我们的数据指出SNP在外显子20中的关键作用导致EGFR-AS1内的单核苷酸变体影响该lncRNA的稳定性-可能是由于高级结构的变化。沿着编码EGFR-AS1的区域的其他同义和非同义突变可以调节EGFR敏感度也是合理的。尽管EGFR-AS1水平影响EGFR转录本的可变剪接的机制仍然知之甚少，但我们假设直接顺式介导的效应导致同基因转录本D：异构体A比例增加。EGFR-AS1转录本在细胞核中的定位，其中该lncRNA可以影响转录和/或前mRNA加工，这支持了这一假设（通过RNA原位杂交观察到；图4b）。进一步的证据来自于20世纪90年代早期发表的一项有趣的研究，其中一种来自EGFR基因的天然反义RNA被描述为调节EGFR基因剪接。未来的研究应着眼于提高对转录本结构，二级结构，表达调控或剪接变体（如果存在）的功能意义的理解。值得注意的是，操纵基因型从A/A到G/A，或更直接地降低EGFR-AS1 lncRNA的水平（体外和体内），足以以一致和可预测的方式增加对EGFR TKI的敏感性，这通过敲低EGFR同基因转录本D可以消除这种作用，这可能是该表型的效应物。

迄今为止，天然存在的EGFR同基因转录本的作用研究很少，一些研究表明，替代同基因转录本在血浆中分泌（作为分泌的EGFR或sEGFR），并且可能与肺癌和宫颈癌中预后有关。之前的一项研究表明，同基因转录本D水平的增加（如此处所示）导致对吉非替尼的敏感性增加，尽管该研究基于单个子宫内膜癌细胞系。此外，对使用erlo-tinib治疗的非小细胞肺癌患者的sEGFR水平进行分析支持了这样的观点，即更高水平的sEGFR可预测对TKI的敏感性，尽管研究者没有区分测量的特定同基因转录本。正如我们的研究所证明的，缺乏酪氨酸激酶结构域的同基因转录本D相对于全长同工酶A的相对增加，以及需要配体驱动的EGFR激活，提示了涉及细胞外结构域的机制。虽然缺乏针对每种EGFR同基因转录本的特异性抗体对空间定位和定量施加限制，但mRNA转录本的分析可能是一种可行的替代方法，如此处使用实时RT-PCR或RNAscope所示。

从我们的数据中得出了几个值得注意的含义。我们已经证明lncRNA EGFR-AS1是EGFR敏感度的真正驱动因素，并且代表SCC子集中的新治疗靶标，其可能通过已经进入临床测试的基于RNA干扰（RNAi）的策略靶向。同义改变影响EGFR敏感度的能力为发现现有靶向治疗的先前未知的生物标志物开辟了新的途径，具有相当大的潜在的临床影响。值得注意的是，这种SNP（纯合A/A基因型）的流行率在亚洲人群中为4％（如本文所述），但在欧洲血统人群中有30％（见URL），这增加了临床适用性地理差异的可能性。 EGFR-AS1基因上可能存在其他单核苷酸变异，这些变异也可能影响lncRNA转录本的稳定性和/或功能，但传统的EGFR或外显子组测序分析未检测到这些变异。正在进行的和未来的前瞻性临床研究需要扩展我们的研究结果中描述的特征验证，作为对EGFR TKI反应的可靠生物标志物，并进一步阐明lncRNA表达和EGFR途径激活的其他决定因素，如组织学和/或表观遗传学背景。总之，我们已经描绘了激活EGFR途径的替代生物标志物路线图 - 从基因型开始并导致EGFR-AS1 lncRNA水平的改变，相对EGFR同基因转录本表达和配体表达 - 强调了建立多维分层生物标志物套件的需要。

（注：本研究未说明是如何发现这个SNP位点，也没有交代lncRNA，及EGFR同基因不同转录本D与A表达比率参与影响发现过程，小编以为通过找到典型病人后，外显子测序，RNAseq差不多可以发现，但仍要具有考虑这方面的意识才好。）