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lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling

文字:[大][中][小] 2018/10/26     浏览次数:    

lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling

lncRNA MIR100HG衍生的miR-100和miR-125b通过Wnt/β-catenin信号传导介导西妥昔单抗耐药

 

杂志:Nature medicine; 影响因子:32.621

发表单位:范德比尔特大学医学中心 


导读


   肿瘤耐药是一个普遍现象,西妥昔单抗是针对表皮生长因子受体EGFR常见靶向药,但常出现耐药性,本研究对耐药和不耐药的结直肠癌细胞进行外显子测序,RNA-Seq。未发现重要的位点突变,RNA-Seq数据中发现lncRNA MIR100HG,miRNA miR-125b和miR-100差异最为明显,后两个miRNA是前者lncRNA基因座上转录出来的。实验发现MIR100HG,miR-125b和miR-100的高表达提高了癌细胞耐药性。富集分析发现Wnt通路显著激活,miR-125b和miR-100可以抑制Wnt通路五种负调节因子表达。通过分析调节MIR100HG表达的转录因子发现GATA6可以抑制MIR100HG的转录,同时miR-125b可以抑制GATA6的表达,GATA6,MIR100HG和miR-125b之间形成双负反馈调节通路调节耐药。


1 摘要


   原发性和获得性耐药主要原因是遗传改变,是抗表皮生长因子受体(EGFR)高效治疗的障碍。为了获得西妥昔单抗耐药细胞,我们在三维培养中将西妥昔单抗敏感的结直肠癌细胞用西妥昔单抗处理。使用全外显子组测序和转录组分析,我们发现长非编码RNA MIR100HG和两个衍生的microRNA,miR-100和miR-125b高表达。在西妥昔单抗耐药结直肠癌和头颈部鳞状细胞癌细胞系以及西妥昔单抗耐药结直肠癌患者的肿瘤中也观察到MIR100HG,miR-100和miR-125b高表达。miR-100和miR-125b协同抑制5个Wnt /β-catenin负调节因子,导致Wnt信号通路激活,并且西妥昔单抗耐药细胞中的Wnt抑制,恢复了西妥昔单抗药效。我们的结果描述了MIR100HG和转录因子GATA6之间的双负反馈调节,其中GATA6抑制MIR100HG,但是这种抑制通过miR-125b靶向GATA6而减轻。这些发现确定了西妥昔单抗耐药的临床潜在的表观遗传原因。


2 研究背景


   结直肠癌(CRC)仍然是全球癌症死亡的主要原因。西妥昔单抗和帕尼单抗是EGFR单克隆抗体(mAb),其结合EGFR的细胞外结构域并增强受体内化和降解。这些EGFR mAb是野生型KRAS转移性CRC患者的常见靶向药物。当作为单一疗法治疗时,EGFR mAb在12-17%的患者中产生持久反应,并且当mAb与化学疗法组合时高达72%的反应率。然而,经常出现耐药性。大量努力已经确定了许多原发性和获得性EGFR mAb治疗耐药遗传机制,包括KRAS,NRAS,BRAF,PIK3CA和EGFR突变。然而,关于非遗传耐药机制知之甚少。

   非编码RNA(ncRNA),特别是长非编码RNA(lncRNA)和microRNA(miRNA),对表观遗传调控至关重要。最近,已发现这两类调节性ncRNA之间的复杂相互作用,其中一些lncRNA被加工以产生抑制靶mRNA的miRNA。例如,lncRNA-H19衍生的miR-675抑制胰岛素生长因子受体的翻译,抑制细胞应激时细胞增殖或致癌信号。由lncRNA MIR17HG基因座产生的miR-17~92减弱TGF-β信号通路,刺激血管生成和肿瘤生长。lncRNA MIR100HG衍生的miRNA miR-100,let-7a-2和miR-125b-1簇以及MIR99AHG衍生的miRNA miR-99a,let-7c和miR-125b-2簇参与急性巨核细胞白血病的发病机制。然而,这些lncRNA或衍生的miRNA是否参与耐药性在很大程度上是未知的。

   我们确定了lncRNA MIR100HG和两种衍生的miRNA(miR-100和miR-125b)在西妥昔单抗耐药中的作用。我们发现MIR100HG,miR-100和miR-125b在原发性和在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞系中获得西妥昔单抗耐药的过程中高表达。miR-100和miR-125b协调下调经典Wnt /β-catenin信号传导(以下称为Wnt信号传导)的5种负调节因子(DKK1,DKK3,ZNRF3,RNF43和APC2),导致Wnt信号传导增加。体外和体内Wnt抑制恢复了对西妥昔单抗的响应。我们发现这些事件发生在肿瘤在西妥昔单抗耐药的CRC患者中。我们还发现MIR100HG过表达通过miR-125b抑制GATA6得到加强,GATA6在稳态下抑制MIR100HG。我们的研究结果确定了西妥昔单抗耐药的表观遗传原因,具有诊断和治疗意义。


3 结果


1 在三维培养中建立西妥昔单抗耐药细胞

   我们将来自人KRAS/NRAS/BRAF野生型,微卫星不稳定的CRC细胞系HCA-7的单细胞置于1型胶原的三维(3D)培养物中,从具有囊性形态的菌落中获得细胞系,我们指定囊性菌落(CC)。西妥昔单抗在3D培养中抑制CC的增殖,但在二维(2D)培养中则不然。在3D培养中连续暴露于西妥昔单抗约4个月后,我们产生了西妥昔单抗耐药CC(CC-CR;图1a)。在2D培养中,CC和CC-CR在形态上无法区分。然而,在3D培养中,CC形成中空囊肿,其中心腔由单层极化细胞排列,而CC-CR形成固体无序菌落(图1b)。正如预期的那样,西妥昔单抗抑制3D培养中CC生长,而CC-CR仍然是西妥昔单抗耐药的直到200μg/ml(图1c和补充图1a,b)。在西妥昔单抗治疗后24小时,我们观察到增殖标志物Ki-67的表达减少和凋亡标志物Caspase-3表达增加,但这些指数在CC-CR中未受影响(图1d)。在西妥昔单抗中-在治疗CC后,我们观察到p-EGFR,p-ERK1/2,p-AKT和细胞周期蛋白D1水平降低,以及裂解的Caspase-3和促凋亡标志物BIM增加;这些标志物在西妥昔单抗治疗的CC-CR中基本上没有受到影响(图1e)。接下来,我们用表达GFP的慢病毒载体稳定地转染CC和CC-CR,然后将细胞系皮下注射到无胸腺裸鼠中。CC肿瘤在西妥昔单抗给药后得到很好的分化和消退。CC-CR肿瘤分化差,并且在西妥昔单抗存在下继续生长,尽管未达到未治疗肿瘤的程度(图1f,g和补充图1c-e)。


2 上调西妥昔单抗耐药细胞中MIR100HG和衍生的miR-100和miR-125b的上调

   我们首先考虑了该3D模型中已知的西妥昔单抗耐药机制。使用全外显子组测序和RNA测序(RNA-Seq),我们未发现与西妥昔单抗耐药相关的已知遗传事件,包括所有报道的基因突变,拷贝数变化和基因融合事件(补充表1)。使用RNA-Seq,我们发现141个转录本上调,220个转录本在CC-CR中与CC相比下调(倍数变化> 2且错误发现率(FDR)<0.01)。ERBB1-4,七种EGFR配体和MET的表达水平在CC和CC-CR之间是相当的(补充表2)。免疫荧光还显示CC和CC-CR中的等效细胞表面EGFR染色(补充图1f)。小RNA-Seq检测到7个上调的miRNA和24个在CC-CR中与CC相比下调的miRNA(倍数变化> 2且FDR <0.01)。值得注意的是,CC-CR中最上调的转录物是lncRNA MIR100HG,并且两种最上调的miRNA是miR-125b和miR-100(图2a)。


   MIR100HG是11号染色体上miR-100,let-7a-2和miR-125b-1簇的宿主基因(图2b)。定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析证实了在西妥昔单抗存在或不存在下CC-CR中内源性MIR100HG表达的上调(图2c)。pri-miR-100,pri-miR-125b-1及其相应的成熟miRNA,miR-100和miR-125b也富含在CC-CR(图2c和补充图2a)。尽管pri-let-7a-2在CC-CR中上调,但成熟let-7a表达与CC相比没有变化(补充图2b)。通过5'RACE-PCR(补充图2c)证实MIR100HG的转录起始位点(TSS)。癌症基因组图谱(TCGA)CRC数据库的分析显示miR-100和miR-125b表达与MIR100HG表达紧密相关(图2d)。RNA荧光原位杂交(FISH)显示在CC-CR肿瘤异种移植物中高度富集的MIR100HG,miR-100和miR-125b表达(图2e)。相反,let-7a表达与MIR100HG的表达无关(补充图2d)。

   为了评估MIR100HG,miR-100和miR-125b是否不只在这一个细胞系高表达,我们根据已发表的数据检查了它们在30个CRC细胞系中的表达,这些细胞系基于西妥昔单抗敏感性和耐药性(补充表3)。与更敏感的细胞系相比,MIR100HG,miR-100和miR-125b在西妥昔单抗耐药细胞系表达更多(图2f)。无论KRAS/BRAF突变状态如何,它们的表达与西妥昔单抗耐药呈负相关(补充图2e,f)。例如,西妥昔单抗敏感的两个细胞(GEO和SW403)表达低水平的MIR100HG,miR-100和miR-125b,尽管含有突变体KRAS。此外,我们还观察到在HNSCC细胞系中西妥昔单抗耐药中MIR100HG,miR-100和miR-125b的上调(补充图3a)。因此,MIR100HG,miR-100和miR-125b在CRC和HNSCC细胞系中的西妥昔单抗耐药中上调,并且这种现象发生在获得性和新生耐药中。这些发现使我们进一步探索MIR100HG,miR-100和miR-125b在西妥昔单抗耐药中的功能。


3 miR-100和miR-125b协同作用驱动西妥昔单抗耐药

   鉴于某些lncRNA的主要作用是产生miRNA,我们研究西妥昔单抗耐药是否由miR-100和miR-125b过表达介导。为此,我们分别将基于慢病毒过表达和海绵构建体分别转入CC和CC-CR,以产生表达miRNA的稳定细胞系,miR-100/ miR-125b双顺反子或其相应的海绵(补充图3b, C)。虽然miR-100海绵对3D培养中CC-CR的菌落数没有显著影响,但miR-125b和双顺反子海绵都显著减少了菌落数(图3a)。在西妥昔单抗存在下,miR-100海绵适度减少了菌落数,而miR-125b海绵和双顺反子海绵的菌落数减少更明显(图3a)。在miR-100和miR-125b过表达后,CC中观察到相反的效应,无论是单独还是一起。 miR-100/miR-125b双顺反子,但不是单个miRNA,增加了CC中的菌落数(图3b)。西妥昔单抗治疗后,miR-100/miR-125b双顺反子具有最强的促存活效果;当单独引入时,miR-125b比miR-100具有更大的作用(图3b)。在CC-CR中的不同海绵和CC中的不同miRNA表达后,在形态学变化以及Ki-67和裂解的Caspase-3染色中观察到类似的相反效应(图3c,d和补充图3D,E)。此外,miR-100/miR-125b双顺反子在Caco-2细胞中过表达(低内源性miR-100/miR-125b表达)使细胞对西妥昔单抗的反应性降低,而miR-100/miR-125b的抑制作用降低。DLD-1细胞中的125b双顺反子和来自HNSCC SCC25的CTX-R7细胞(均具有高内源性miR-100/miR-125b表达)恢复了西妥昔单抗反应性(补充图4)。当具有不同操作的CC-CR和CC细胞在裸鼠中建立为皮下异种移植物并用西妥昔单抗治疗时观察到类似的结果(图3e,f和补充图5)。总之,这些结果与miR-100和miR-125b协同赋予西妥昔单抗耐药的模型一致。


4 miR-100和miR-125b抑制多个Wnt负调节因子并增加Wnt信号传导

   为了理解miR-100和miR-125b如何影响西妥昔单抗的反应,我们认为CC-CR中最下调的基因是这些miRNA的潜在靶标。与CC相比,CC-CR中Wnt信号传导的两个负调节因子DKK1和DKK3的表达降低了30倍以上(图2a)。通过分析64个共有β-catenin靶基因(补充图6a)确定,CC-CR中Wnt活性增强。对大型人类CRC数据集(n = 458例)的分析也显示MIR100HG表达水平与Wnt评分呈正相关,而在MIR100HG与Ras-Az评分之间未观察到相关性,MEK活化引起下游RAS信号产生(补充图6a和数据未示出)。功能富集分析进一步鉴定了miR-100和miR-125b靶标中的Wnt途径富集(补充表4)。因此,我们考虑了miR-100和miR-125b是否可能靶向Wnt信号传导的组分。使用靶基因预测,我们发现DKK1和DKK3的3个非翻译区(UTR)分别含有miR-100和miR-125b的结合位点(图4a)。鉴于聚集的miRNA共表达并且通常通过靶向相同途径的不同组分来协调调节分子途径,我们搜索了包含miR-100或miR-125b的推测结合位点的Wnt信号传导的其他负调节因子,并鉴定了ZNRF3,RNF43和APC2作为单独或组合的miR-100或miR-125b的潜在靶标(图4a和补充表5)。通过细胞系中的免疫印迹和异种移植物中的免疫染色证实CC-CR中这五种Wnt阴性调节剂与CC相比的蛋白质水平降低(补充图6b,c)。使用3'UTR荧光素酶报告基因测定,我们证实这五种候选物是CC和Caco-2细胞中miR-100和/或miR-125b的直接靶标。通过相应结合位点的突变挽救了这些基因的抑制(图4b,c和补充图6d)。免疫印迹证实miR-100和miR-125b单独或在CC和CC-CR中组合对预测靶标的调节(图4d)。一致地,在Caco-2细胞(低内源性miR-100/miR-125b表达)和HuTu80细胞(高内源性miR-100/miR-125b表达)中也观察到该调节(补充图6e)。

   我们接下来检查了miR-100-和miR-125b诱导的这些Wnt负调节因子的下调是否导致Wnt信号传导增加。尽管总β-catenin水平没有显著改变,但与3D培养中的CC相比,CC-CR显示出活性酪氨酸磷酸化的p-Y489 β-catenin和增加的核β-catenin增加(图4e和补充图6f)。一致地,β-catenin主要局限于CC异种移植物中的质膜,而其在CC-CR异种移植物中主要是核(图4f)。此外,一组Wnt靶基因的mRNA表达在CC-CR与CC中显著富集(图4g)。西妥昔单抗阻断了CC中Wnt3a诱导的Wnt激活,但对CC-CR中Wnt3a诱导的Wnt信号传导没有明显影响(补充图6g)。西妥昔单抗治疗也导致CC中Wnt靶基因在48小时内显著且持续减少,而CC-CR中这些基因的表达在治疗后的早期时间点仅略微下降,并在稍后的时间点反弹(补充图 6H)。此外,在稳定过表达miR-100或miR-125b的CC和Caco-2细胞中核β-catenin水平增加,并且在表达miR-100/miR-125b双顺反子的细胞中增加更多(补充图7a)。相反,在CC-CR,DLD-1和CTX-R7细胞中过表达miR-100/miR-125b双顺反子海绵后,核β-catenin水平降低(补充图7a)。还观察到Wnt靶基因的相应变化(图4h和补充图4e)。与这些发现一致,核β-catenin免疫反应性在表达miR-100/miR-125b双顺反子的CC裸鼠异种移植物中增加,并且在表达双顺反子海绵的CC-CR对应物中减少(补充图7b)。

   基于我们在CC-CR中增加Wnt信号传导的发现,我们假设通过抑制Wnt信号传导可以恢复西妥昔单抗反应性。鉴于DKK1和DKK3是分泌的Wnt拮抗剂并且是CC-CR中最下调的基因之一,我们测试了它们的过表达是否可以使用强力霉素诱导的慢病毒系统来克服西妥昔单抗耐药。虽然DKK1或DKK3的诱导导致菌落数略微减少,但通过添加西妥昔单抗增强了这种效果(补充图8a,b)。此外,重组DKK1和DKK3的施用增强了西妥昔单抗降低增殖和增加细胞凋亡的能力(补充图8c)。此外,当在西妥昔单抗存在下在CC-CR中诱导表达DKK1或DKK3时,核β-catenin表达降低(补充图8d)。我们接下来测试了使用端锚聚合酶抑制剂XAV-939和β-catenin/ CBP抑制剂ICG-001对Wnt活性的药理学抑制是否使CC-CR对西妥昔单抗敏感。两种化合物均引起菌落数的浓度依赖性降低,并且通过添加增强西妥昔单抗生长抑制(补充图8e)。ICG-001还增强了西妥昔单抗在具有高表达MIR100HG的其他CRC和HNSCC细胞系中的生长抑制作用(补充图4e和8f)。在CC-CR裸鼠异种移植物中,单独给予西妥昔单抗和ICG-001仅减缓肿瘤生长;然而,联合治疗导致肿瘤消退(图4i-k和补充图8g,h)。因此,在APC/β-catenin降解复合物的上游或下游阻断Wnt信号传导,恢复西妥昔单抗对西妥昔单抗耐药细胞的反应性。


5 GATA6和MIR100HG/miR-125b之间的相互负调节

   为了探索miR-100和miR-125b在CC-CR中上调的机制,我们研究了宿主基因MIR100HG的转录调节。使用Match程序(版本1.0)在计算机中绘制含有MIR100HG的2.5kb启动子中的结合位点的可能转录因子,并与RNA-Seq数据集取交集(补充表6)。在这些转录因子中,我们关注的是锌指转录因子GATA6,其在3D培养和裸鼠异种移植物中在CC-CR的mRNA和蛋白水平均下调(图2a和5a-c)。

   GATA6对于肠道内胚层发育至关重要,它可以促进和抑制胃肠道和胰腺肿瘤。我们发现在西妥昔单抗处理的CC中MIR100HG表达降低,而GATA6 mRNA在48小时内逐渐增加(图5d);然而,这种现象在CC-CR中没有发生(数据未显示)。CC中的GATA6敲低(图5e,上图和补充图9a)导致MIR100HG上调,并且在西妥昔单抗治疗后其表达不再降低(图5e,下图),表明GATA6对MIR100HG的抑制作用。荧光素酶报告基因测定显示,GATA6的过表达(补充图9b)导致MIR100HG启动子活性的浓度依赖性抑制(图5f)。在MIR100HG启动子区域中鉴定出四个推测的GATA结合位点(G/A)GATA(A/T)(图5g)。这些结合位点的顺序缺失和突变揭示GATA结合位点2(TSS上游的-1,198)是GATA6抑制MIR100HG转录活性的主要位点(图5h)。MIR100HG的GATA6抑制也在HuTu80细胞中得到验证,其具有低表达的GATA6和高表达的MIR100HG(补充图9c,d)。通过使用来自CC细胞的核提取物的染色质免疫沉淀和电动移位测定证实GATA6在GATA结合位点2处的染色质占据(补充图9e,f)。

   有趣的是,我们发现GATA6的3'UTR含有miR-125b的推测结合位点(补充表5)。在CC和Caco-2细胞中,miR-125b的引入降低了野生型3'UTR报道构建体的荧光素酶活性,但是当miR-125b位点突变时却没有(图5i和补充图9g)。如所预测的,在稳定表达miR-125b的CC和Caco-2细胞中GATA6水平降低,并且在表达miR-125b海绵的CC-CR和HuTu80细胞中相反地增加(图5j和补充图9h)。对TCGA数据库的进一步分析显示,在IV期CRC患者中,GATA6显著下调,而MIR100HG显著上调(图5k)。此外,具有较低四分位数表达的GATA6的CRC在TCGA数据库中倾向于具有较高的MIR100HG表达(图5k),以及另外两个CRC数据集(补充图9i)。总之,这些研究结果表明,GATA6,MIR100HG和miR-125b之间的双负调节通路是西妥昔单抗耐药的基础。


6 西妥昔单抗耐药时CRC标本中MIR100HG,miR-100和miR-125b表达增加

   为了检查这种西妥昔单抗耐药模式是否发生在人类CRC中,我们在西妥昔单抗治疗开始前和肿瘤进展时从10个个体中获得了成对的肿瘤标本(补充表7)。在用西妥昔单抗治疗之前获得的肿瘤标本中排除了KRAS/NRAS/BRAF突变。qRT-PCR显示,与治疗前水平相比,miR-100和miR-125b在治疗进展的肿瘤中协同过表达(rs = 0.842,P <0.01)(P <0.05;图6a)。此外,在西妥昔单抗上发展的肿瘤中,核β-catenin免疫反应性显著升高(图6b)。 miR-125b的表达与核β-catenin染色直接相关(rs = 0.636,P <0.05); miR-100表达与核β-catenin染色之间的相关性未达到统计学显著性(rs = 0.612,P = 0.06)。与我们的临床研究结果相反且一致,在西妥昔单抗上进展的肿瘤中核GATA6表达减少(图6c)。然而,我们未发现miR-100和GATA6(rs =-0.455,P = 0.187)或miR-125b和GATA6(rs =-0.515,P = 0.128)之间存在显著的负相关。使用FISH分析,我们发现MIR100HG,miR-100和miR-125b信号在治疗进展的肿瘤中增加。在这些相同的样品中,β-catenin染色增加并且GATA6染色减少(图6d)。我们在所有10个配对样本中排除了通过FISH进行的MET扩增,并对治疗后肿瘤进行了KRAS/NRAS/BRAF突变的测序(补充图9j和补充表8)。分别在两例中检测到NRAS和KRAS突变;我们确认这些可能是通过对治疗前DNA进行重新测序而获得的事件。在两种情况下,MIR100HG,miR-100和miR-125b表达均增加。在剩余的8例缺乏遗传耐药事件的病例中,5例病例在治疗后的肿瘤中表现出上调的MIR100HG,miR-100和miR-125b。这些临床数据支持我们的临床前研究结果并证明MIR100HG,miR-100和miR-125b的上调发生在CRC患者获得性西妥昔单抗耐药的情况下,并且这种上调可能与基因突变相关也可能独立于与之相关的基因突变。

 

4 讨论


   MIR100HG是一种多顺反子miRNA宿主基因,在其第三个内含子中编码miR-100,let-7a-2和miR-125b-1。首次报道MIR100HG参与人间充质干细胞的命运,后来发现其在急性巨核细胞白血病中高度表达。MIR100HG表达增加与宫颈癌预后不良有关,而其表达在乳腺癌中由于高甲基化而降低。miR-100和miR-125b的表达增加也与临床样本中的胃癌进展相关。在我们的研究中,伴随的MIR100HG,miR-100和miR-125b的上调发生在CRC和HNSCC细胞系中获得性和原发西妥昔单抗耐药的处理中。此外,我们发现这些事件可能与KRAS/NRAS/BRAF突变和西妥昔单抗耐药的CRC患者肿瘤共同发生。对TCGA CRC数据库的分析揭示了MIR100HG表达的阶段依赖性增加。这些数据支持MIR100HG,miR-100和miR-125b是西妥昔单抗耐药的潜在预测生物标志物的假设。

   我们通过靶向Wnt信号传导的五个负调节因子确定miR-100和miR-125b协调地促成西妥昔单抗耐药。miR-100靶向DKK1和ZNRF3,miR-125b靶向ZNRF3,RNF43,DKK3和APC2。Wnt信号传递受到严格调控,负调控分子在许多不同的层面上发挥作用。DKK1和DKK3是Dickkopf家族的分泌型Wnt信号传导拮抗剂。DKK1通过结合和内化Wnt共受体LRP5/6起作用,而尚不清楚DKK3如何减弱Wnt信号传导。 ZNRF3和RNF43是两个密切相关的跨膜E3泛素连接酶,它通过Wnt受体Frizzled及其共受体LRP5/6的泛素化和降解来拮抗Wnt信号传导。虽然已报道ZNRF3/RNF43的失活突变,但我们的数据表明,miR-100和miR-125b的下调可能是减弱ZNRF3/RNF43功能的替代机制。APC2靶向β-catenin,并且在功能上与APC41互补;最近报道,APC2将TNKS募集到β-catenin破坏复合物以调节β-catenin蛋白水解。我们之前已将APC鉴定为miR-125b在白血病细胞中的靶标,但未检测CC或CC-CR中的APC,因为它在这些细胞中发生突变。然而,最近报道miR-125b在具有野生型APC43的突变体β-catenin HCT116细胞中产生APC。我们的研究结果表明,miR-100和miR-125b共同作用靶向这五种Wnt负调节因子,为聚集的miRNA提供了一种先前未知的调节模式,以协同调节该途径。

   我们不能排除miR-100和miR-125b通过除Wnt信号传导之外的方式促成西妥昔单抗耐药的可能性。例如,miR-125b可通过靶向液泡蛋白分选4同源物B(Vps4b)和间接延长EGFR活性来增强皮肤中的肿瘤形成。然而,我们观察到CC和CC-CR之间的VPS4b表达没有差异。我们还没有排除全长3-kb MIR100HG转录物对Wnt信号传导的影响。

   我们的研究结果增加了描述EGFR和Wnt信号传导之间串扰。例如,在APC-突变体CRC中,增加的EGFR信号传导增强了Wnt活性,支持Wnt信号传导在受损的β-catenin降解复合物的情况下进一步调节的观点。以相反的方式,Wnt配体与其GPCR卷曲蛋白受体的结合通过金属蛋白酶依赖性,EGFR配体的细胞表面胞外域切割导致EGFR反式激活。此外,增加的Wnt信号传导赋予肺癌中EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药。

   增加的Wnt信号传导赋予西妥昔单抗耐药的确切机制尚不确定。据报道,Wnt信号增加肝脏中的EGFR表达。我们观察到西妥昔单抗在CC-CR中没有降低p-EGFR,pERK1/2或p-AKT,而在CC中则降低。虽然CC和CC-CR中存在相同的细胞表面EGFR染色,但这并不排除EGFR内化,再循环和降解速率的差异。展望未来,系统范围的方法应该有助于解开在该系统中解决EGFR/Wnt串扰的机制。

   GATA6在癌症中的作用是复杂的,并且依赖于背景;即使在相同的肿瘤类型中,也存在相互矛盾的证据。例如,GATA6通过激活Wnt信号促进胰腺癌的发生。另外的研究发现,通过维持胰腺分化程序,它可以起到抑制肿瘤的作用。同样,在结肠瘤形成中,已经报道了相反的行为。在结肠腺瘤中,GATA6抑制BMP表达,从而使干细胞自我更新,并且在CRC细胞系中,它增强Lgr5和REG4的表达以分别促进克隆形成和生长。相反,我们的数据支持GATA6在CRC中的肿瘤抑制作用。对TCGA CRC数据库的分析显示,IV期CRC中GATA6表达减少,同时MIR100HG表达增加。GATA6的表达降低将允许MIR100HG的表达增加,并且miR-125b的相应增加的表达将加强GATA6的抑制。在这种情况下,GATA6通过阻止Wnt信号增强的西妥昔单抗耐药起到抑制肿瘤作用的作用。

   我们的研究结果对CRC和HNSCC具有重要的治疗意义。越来越多的人认识到CRC56中存在Wnt信号的梯度,并且可以在APC功能丧失的中调制Wnt信号。在我们的模型中,MIR100HG,miR-100-和miR-125b介导的Wnt活化代表通过激活代偿途径适应在EGFR抑制下存活的细胞。我们发现单独诱导DKK1或DKK3,或重组DKK1和DKK3的组合,克服了CC-CR中的西妥昔单抗耐药。抑制剂XAV-939和β-catenin CBP抑制剂ICG-001均增强了西妥昔单抗的生长抑制作用。我们建议未来用野生型KRAS/NRAS/BRAF CRC进行的个体试验应考虑MIR100HG表达水平。

   总之,我们已经通过上调MIR100HG及其衍生的miRNA来鉴定了西妥昔单抗耐药的复杂通路。 miR-100和miR-125b通过减少Wnt信号传导的五种负调节物的表达来协调激活Wnt信号传导。miR-125b通过抑制通常抑制MIR100HG的GATA6表达来加强MIR100HG的上调。我们发现抑制Wnt信号传导可以克服这种西妥昔单抗耐药模式,强调了EGFR和Wnt信号传导之间相互作用的潜在临床相关性。




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