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Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA
一个保守的癌/睾丸lncRNA THOR的致癌功能
期刊：cell；影响因子：31.398
发表单位：密歇根大学转化病理学中心
导读
RNAseq得到差异lncRNA那么多，该如何找到那个想要的lncRNA? 本研究提供了一个很好的角度。本研究作者对人类转录组RNA-seq数据进行lncRNA保守性分析，发现了82个具有超守区域的lncRNA，而后结合基因组织表达特异性，发现了THOR和CRNDE在睾丸组织中特异性表达，尤其是THOR特异性很高，其他正常组织几乎没有表达。而后以THOR为对象进行研究，根据RNAseq数据发现其周围基因没有显著变化，证实其不是通过cis顺式调控临近基因发挥作用。作者使用RNA pull-down，而后质谱鉴定结合蛋白，发现IGF2BP是其主要结合蛋白，有报道称IGF2BP1也具有睾丸特异性表达的特征，IGF2BP1与其他一系列蛋白质和信使核糖核蛋白（mRNP）复合物一起介导RNA稳定性和翻译，通过过表达，敲除THOR，IGF2BP1验证靶标mRNA表达量变化，揭示THOR结合IGF2BP1与其他蛋白一起形成复合物调控靶标基因表达的机制。
1 摘要
大规模转录组测序大大扩展了具有不同进化保守性，谱系表达和癌症特异性的长非编码RNA（lncRNA）的分类。在这里，我们功能鉴定了一种新的超保守lncRNA，THOR（ENSG00000226856），仅在睾丸和广泛的人类癌症中表现出表达。多种细胞系和动物模型中的THOR敲低和过表达改变了细胞致癌作用的或肿瘤生长。我们发现THOR与IGF2BP1具有保守相互作用，THOR有助于IGF2BP1的mRNA稳定活性。值得注意的是，转基因THOR敲除在斑马鱼中产生了受精缺陷，并且还赋予了对黑素瘤发病的抗性。同样，斑马鱼中人THOR的异种移植表达加速了黑素瘤的发生。THOR代表一类新的功能重要的癌症/睾丸lncRNAs，其结构和功能经历了积极的进化选择。
2 研究背景
长非编码RNA（lncRNA）是一种具有表达丰富且功能多样ncRNA，在多种物种出现。尽管它们在转录组中具有惊人的普遍性以及无数次研究过其功能，但我们对绝大多数lncRNA功能的理解仍然是很少，使得它们的分类特别具有挑战性。新的lncRNA类别继续被鉴定，其分类标准主要与其功能作用和保守性相关。
尽管lncRNA的普遍保守水平一直存在争议，但有一个明确的lncRNA亚类是高度保守的，其中许多具有“超保守”区域（即，至少200bp的几乎完美的脊椎动物保守性）。高度保守性提示细胞功能相关的特征，也有助于对模式生物中的lncRNA进行特征和机理研究。
在这里，我们定义了一类新的lncRNA，仅在正常组织睾丸表达，并在多种类型癌症中广泛表达。这种癌症/睾丸表达模式是癌症/睾丸抗原的特征，癌症/睾丸抗原是一种明确定义的蛋白质类别，已被建议作为癌症治疗的靶标。在这里，我们鉴定THOR（睾丸相关的高度保守的致癌长非编码RNA）并研究其在肿瘤发生和睾丸生理学中的作用，鉴定与IGF2 mRNA结合蛋白（IGF2BPs）的进化上保守的功能性相互作用。 此外，我们将THOR的保守序列生成转基因斑马鱼模型，揭示其在睾丸和癌症中的功能。
3 结果
1 THOR发现，一种在睾丸中表达的保守lncRNA
在最近的大规模RNA测序（RNA-seq）分析中，我们全面分析了人类转录组，发现了数以万计的新lncRNA。虽然lncRNAs往往比蛋白质编码基因保守性低（图S1A），并且大多数没有表现出明显的序列保守性，但确实存在一组保守的lncRNA（图1A）。我们测量了整个转录本的平均碱基保守性（图1A，x轴）和最佳200-bp窗口的保守水平（图1A，y轴），这是先前用于确定超保守元素的测量方法。我们在组织RNA-seq中鉴定了82个超保守基因间lncRNA，其在1％的样品中表达至少1个FPKM（图1A和1B以及表S1）。尽管拥有200 bp的超保守片段，但这些lncRNAs具有不同程度的碱基保守性（图1B，顶部;范围0.1％-55.4％保守碱基），THOR表现出第二高的碱基保守程度。有趣的是，当研究基因型-组织表达（GTEx）良性组织RNA-seq数据集时，这些超保守的lncRNA中的两个，即THOR和CRNDE，在睾丸中显示出有意义表达（图1B，底部）。由于其睾丸特异性表达模式（图1C）与CRNDE的混杂表达（图S1B）相比，我们进一步关注THOR。
2 转录THOR同系物存在于小鼠和斑马鱼中
使用5’和3’快速扩增cDNA末端（RACE），我们鉴定了两种THOR剪接体，由2号染色体上的2或3个外显子组成（图S1C和表S2）。另外，通过H1299人肺腺癌细胞系中的RNA印迹证实存在THOR的3-外显子剪接体（图S2A）。虽然GENCODE注释基因具有额外的较大剪接体和下游外显子，但在该研究中使用的任何细胞系中均未检测到该剪接体的表达（图S2B），并且THOR靶向siRNA未改变表达长剪接体（图S2C）。鉴于其序列保守性，我们尝试确定其他物种中的THOR同源转录本。利用BLAST比对工具（BLAT），我们鉴定了小鼠和斑马鱼基因组中与人THOR同源的预测区域（h-THOR，Ensemble ID：ENSG00000226856）（图1D）。另外，我们在小鼠THOR（m-THOR）中证实了2-外显子同源转录本（图S1D和表S2），并且在斑马鱼THOR（z-THOR）中证实了2个单体异构体同源转录本（图S1E和表S2）。还通过northern印迹检测到较短的斑马鱼剪接体（图S2D）。h-THOR的保守性延伸到外显子2和3，以m-THOR和z-THOR表示（图1D）。THOR的进一步特征分析证实它是非编码转录物（图S2E-S2G）。
3 THOR在正常组织中表现出进化保守的表达模式
为了验证GTEx RNA-seq数据中观察到的睾丸特异性THOR表达，我们用来自各种正常人组织的cDNA进行qRT-PCR，观察类似的睾丸特异性表达模式（图2A）。此外，使用h-THOR特异性探针的人睾丸组织的RNA原位杂交（ISH）显示在睾丸精母细胞和精子中富集THOR（图2B），但在周围组织中没有（图S2H和S2I）。有趣地是，THOR的这种表达模式与在X染色体上未发现的癌/睾丸抗原报道的类似表达模式。从小鼠和斑马鱼的组织中鉴定了m-THOR（图2C）和z-THOR（图2D）的睾丸特异性表达。此外，我们还观察到在小鼠和斑马鱼的早期发育期间THOR表达升高（图2C和2D，右）。
4 THOR在人类癌症中的表达及功能意义
除了在正常组织中的睾丸特异性表达外，我们还鉴定了THOR在多种类型癌症中的表达，在非睾丸正常组织（图3A）和许多癌细胞系中很少表达，在癌细胞中过表达，特别是在肺癌细胞系中（图3B）。此外，与正常肺样本相比，THOR在肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）中表现出显著的差异表达（图3C）。除了qPCR定量黑素瘤和黑素细胞外，这一癌症特异性表达谱在肿瘤和正常肺的独立存在中得到证实（图3D）。我们通过siRNA和反义寡核苷酸（ASO）在H1299和MM603，非小细胞肺癌（NSCLC）和具有高水平表达THOR的黑素瘤细胞系中进行THOR敲低（图3E，S3A和S3B）观察到这些细胞的增殖能力戏剧性降低（图3F，3G，S3C和S3D）。H1437细胞中的THOR的siRNA和ASO敲低（缺乏内源性THOR表达；图3E）未显示出显著的增殖表型（图S3E和S3F）。通过ASO和siRNA敲低（图3H和S3G-S3I）和siRNA敲低（图S3H），THOR敲低导致软琼脂中的克隆群落形成减少。
此外，我们通过CRISPR-Cas9技术生成THOR敲除细胞系模型，其中双链single-guide RNAs（sgRNA）靶向H1299细胞系中THOR转录本的保守区域。使用多个sgRNA，靶向不同的THOR区域（图S3J），并选择具有稳定敲除的单克隆群用于进一步分析（图S3K和S3L）。THOR敲除的H1299细胞表现出显著降低的细胞增殖（图3I），表型恢复，异常表达THOR（图3I）。这些结果也在敲除克隆的斑块群中出现，表明单克隆的不是由于选择偏倚原因（图S3M-S3O）。进一步证实了靶向效应，H1437细胞中的THOR斑块敲除（图S3P）没有导致增殖减少（图S3Q）。此外，与对照敲除细胞相比，含有THOR敲除的H1299细胞的小鼠异种移植物显示出显著减少的肿瘤生长（图3J）。
在H1437和SKMEL5中具有稳定的慢病毒THOR过表达的细胞（图S3R）显示出增殖能力（图3K和S3S）和软琼脂群落形成（图3L和S3T）的显著增加。另外，与稳定过表达LacZ对照的细胞相比，H1437细胞中稳定过表达THOR的细胞的鼠肿瘤异种移植物表现出显著的增殖能力（图3M）。然而，这一发现在使用SMKEL5细胞的小鼠异种移植物中并不显著（图S3U）。通过Northern印迹对慢病毒质粒的分析显示，除了质粒中包含的剪接体外，还有其他的THOR长剪接体（图S2A）。5’和3’RACE鉴定了较长剪接体中表达的一段质粒（图S2J和S2K）；然而，THOR靶向siRNA确实降低了这种剪接体的水平，表明这种较长剪接体的功能保守性（图S2A）。
5 THOR-IGF2BP1相互作用分析
细胞分解后通过qRT-PCR进行的THOR细胞定位揭示了细胞质和细胞核中的表达（图S4A），这一发现得到了单分子荧光ISH的证实（图S4B-S4H）。为了进一步在功能上分析THOR，我们通过pull-down，质谱鉴定了潜在的THOR蛋白质相互作用物。根据THOR的序列保守性，我们利用多个实验条件来鉴定保守的结合片段：（1）加入人H1299癌细胞裂解物pull-down h-THOR，（2）加入斑马鱼胚胎裂解物pull-down h-THOR，（3）向人H1299癌细胞裂解物中加入z-THOR的pull-down，和（4）向斑马鱼胚胎裂解物中加入z-THOR的pull-down（表S3）。在所有条件下，反义THOR的pull-down被用作阴性对照。在所有四种条件下pull-down两种蛋白质IGF2BP1和IGF2BP3（图4A）。有趣的是，在H1299细胞的细胞核和细胞质组分中，IGF2BP蛋白也是h-THOR pull-down的唯一蛋白质（图S4I），据报道IGF2BP1表现出类似于癌症/睾丸的表达模式（图S4J和S4K）。
IGF2BP1与其他一系列蛋白质与信使核糖核蛋白（mRNP）复合物一起介导RNA稳定性和翻译。在各种条件下通过THOR pull-down mRNP复合物的多个组分（图4A），并且我们通过免疫沉淀和蛋白质印迹证实IGF2BP1，IGF2BP2，IGF2BP3和YBX1存在于复合物中（图4B）。用针对IGF2BP1-3，YBX1，STAU1和HuR的抗体进行RNA免疫沉淀（RIP）测定，然后对THOR和其他对照RNA进行qRT-PCR，证实了THOR-IGF2BP1相互作用的特异性（图4C）。此外，H1437中THOR的过表达导致IGF2BP1和IGF2BP3相互作用的适度增加，表明THOR在介导mRNP复合物形成中的潜在作用（图S4L）。
THOR和IGF2 RNA被mRNP复合物的各种蛋白质pull-down，而阴性对照lncRNAs NEAT1，TINCR和HOTAIR表现出显著降低的pull-down程度（图4C）。尽管如此，HuR一种不在mRNP复合物中的蛋白质（图4B）不会降低这些RNA（图4C），尽管通过免疫印迹确认了强烈的pull-down（图4B）。通过向纯化的myc标记的IGF2BP1添加体外转录的h-THOR证实了THOR和IGF2BP1的直接结合相互作用（图4D）。
pull-down h-THOR的各种缺失剪接体，然后对IGF2BP1进行蛋白质印迹，揭示负责IGF2BP1结合的THOR区域位于外显子2和3中，即h-THOR的保守区域（图4E）。此外，还观察到z-THOR的结果，其中z-THOR的5’端保守部分足以引起斑马鱼igf2bp1蛋白的pull-down（图4F）。 IGF2BP1具有2个RNA识别序列（RRM）结构域和4个Khomology（KH）结构域（图S4M）。使用IGF2BP1的多种重组缺失蛋白，我们发现RRM结构域的缺失不影响THOR结合，而发现KH1，KH3和KH4结构域对于THOR结合是必需的（图S4N）。
6 THOR调节IGF2BP1的目标mRNA水平
据报道，IGF2BP1可调节靶RNA的mRNA稳定性（IGF2，CD44，KRAS，ACTB， PABPC1，GLI1，MYC，MAPT，CTNNB1，PPP1R9B，BTRC，PTEN和H19）。值得注意的是，在H1299和MM603细胞中THOR的敲低后，几乎所有IGF2BP1靶标的水平均降低，而在H1437和SKMEL5细胞中THOR的稳定过表达则相反地增加（图5A和S5A）。正如预期的那样，IGF2BP1的敲低产生了其靶标的减少，而改变IGF2和CD44 2个经典IGF2BP1靶标水平，未能显示出IGF2BP1靶标的表达趋势（图5A）。CRISPR介导的THOR敲除H1299细胞表现出类似的IGF2BP1靶标表达减少，当在这些细胞中表达异常THOR时表型逆转，表明THOR的反式调控功能（图S5B）。
我们假设THOR水平对IGF2BP1靶标的影响（图5A）可以通过THOR介导的IGF2BP1与其靶标相互作用的稳定性来解释。证实这一假设，IGF2BP1靶向IGF2和CD44的qRT-PCR，在THOR敲低背景下IGF2BP1 RIP后，IGF2和CD44的IGF2BP1结合减少，而THOR的过表达增加IGF2和CD44结合。 IGF2和CD44的敲低未产生相同的结果（图5B和S5C）。另外，在放线菌素D处理后，THOR过表达显著增加IGF2BP1靶向IGF2和CD44的mRNA稳定性（图5C），而对GAPDH和UBC的稳定性没有影响，GAPDH和UBC是两种不与IGF2BP1相互作用的对照mRNA（图S5D）。THOR mRNA的半衰期为14小时（图S5E），其长于观察到对IGF2和CD44稳定作用的动态范围（图5C和S5D），证实THOR存在于细胞中足以发挥这些效果。
除了改变IGF2水平（图5A）和调节IGF2-IGF2BP1结合（图5B）之外，THOR还成功调节IGF2的下游信号传导途径（图S5A和S5F），表明THOR介导的IGF2BP1靶标表达变化足以功能性改变下游IGF2信号传导。此外，THOR过表达所赋予的增殖优势通过降低这些细胞中的IGF2BP1水平而消除，在SKMEL5细胞系中具有特别显著的表型（图5D），进一步证实了THOR-IGF2BP1相互作用的功能相关性。另外，H1299和MM603细胞中IGF2BP1的敲低降低了细胞增殖（图S5G和S5H）和软琼脂群落形成（图S5I和S5J）。缺乏保守的IGF2BP1结合序列的THOR缺失构建体的过表达未能表现出在全长THOR过表达中观察到的增强的增殖能力（图5E）。这些数据表明THOR和IGF2BP1之间的结合相互作用与细胞功能相关，这些作用结果对THOR的致癌性有影响。
为了更广泛地评估与IGF2BP1敲低相比的THOR敲低的转录表型，评估了用靶向THOR，IGF2BP1和HUR的两种独立siRNA进行的RNA-seq的差异表达。我们观察到在THOR和IGF2BP1敲低时具有重叠的差异表达基因（图6A和6B）。证实通过siRNA敲低观察到的基因表达变化是靶向效应，通过两个独立的ASO敲低THOR导致基因表达变化与通过siRNA敲低产生的那些一致（图S6A）。然而，作为阴性对照，敲低HUR并没有检测到这些基因表达变化。在敲除THOR和IGF2BP1时最大改变的基因也是高度一致的（Pearson r = 0.50;图6C）。然而，HUR敲除后的基因变化特征与THOR（图S6B）或IGF2BP1（图S6C）敲低后的基因变化无关。有趣的是，与黑素瘤转移和复发相关的两个独立基因特征是IGF2BP1和THOR敲低后改变的最重要基因特征之一（图图6C），进一步暗示THOR-IGF2BP1在癌症进展中的关 - 特别是在黑素瘤中。
为了进一步揭示THOR和IGF2BP1的功能关系，我们进行了IGF2BP1 iCLIP。在过表达THOR的H1437细胞中，在通过缺失构建体pull-down鉴定的相同区域中观察到IGF2BP1对THOR的结合（图4E），而在过表达LacZ对照的H1437细胞中未观察到结合（图S6D）。通过iCLIP将185个基因鉴定为IGF2BP1结合靶标，并且通过RNA-seq测量，观察到这些基因与不是IGF2BP1靶标的基因相比具有显著的表达增加（图S6E和S6F）。另外，H1299中的IGF2BP1 iCLIP证实了IGF2BP1与THOR结合的定位（图S6G）。如上所述，与没有IGF2BP1结合的基因相比，在H1299 iCLIP实验中鉴定为IGF2BP1的结合靶标的基因表现出THOR敲低时表达的显著降低，尽管效果的程度小于H1437实验（图S6H和S6I）。这些高通量数据证实THOR在介导IGF2BP1靶标的RNA稳定性中的潜在影响。进一步利用这些数据，THOR的顺式调控功能被排除掉，THOR表达水平改变时，THOR附近的基因没有表现出显著表达量变化（图S6J）。
7 THOR-Knockout斑马鱼表现出受精缺陷和对黑色素瘤形成抵抗力
鉴于我们观察到THOR的序列保守性（图1A，1B，1D和S1C-S1E），保守的组织表达模式（图2A，2C和2D），以及其与IGF2BP1的结合相互作用的保守性（图4E和4F），我们开始在不同的动物模型中研究THOR的潜在功能，扩展其功能对人癌细胞系的影响（图3和4）。斑马鱼动物模型最近成为癌症研究的相关模型系统。利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统，我们制备了THOR-knockout斑马鱼系。将靶向z-THOR保守区域（图S7A）和Cas9 mRNA的两个sgRNA注射到斑马鱼胚胎中，产生斑块F0生成，随后与野生型斑马鱼交配以产生杂合F1后代（THOR +/-）。然后将杂合子彼此交配以在F2代中产生纯合THOR-敲除斑马鱼（THOR-/-）的群体（图7A）。
获得THOR -/-斑马鱼后，我们观察到与野生型斑马鱼相比，THOR-/-斑马鱼的生育能力有显着的表型变化，其中55％的THOR-/-斑马鱼交配胚胎在受精后6小时死亡而野生型交配的比例仅为11％（图7B）。此外，当将野生型雄性与雌性THOR-/-斑马鱼交配时，受精缺陷大大减少，而将野生型雌性交配到雄性THOR -/-斑马鱼则在斑马鱼后代产生显着的受精缺陷（图7C），THOR在睾丸中的作用，提示THOR在生育中的主要功能作用。此外，发现THOR在减数分裂II中的精母细胞表达，其水平远高于任何其他发育阶段的精子（图7D），并且与野生型斑马鱼相比，THOR-/-斑马鱼的睾丸在减数分裂II中含有较少的细胞（图S7C和S7D）。值得注意的是，在THOR敲低后（图6C，S6B和S6C），表达量改变基因多与减数分裂相关（图S7E和S7F）。在这些特征中，我们观察到在减数分裂中涉及的组蛋白基因上调的显着优势。在THOR敲低后，许多这些减数分裂组蛋白基因被鉴定为一些最积极失调的基因（图S7G）。虽然THOR在生育中的作用机制需要进一步阐明，但我们已经证明THOR在某些睾丸细胞内的时空定位，特别是在减数分裂II期间，并且已经证明了由THOR调节的那些基因也与减数分裂有关的确凿证据。
利用斑马鱼模型进一步研究THOR在肿瘤发生中的作用，我们分析了斑马鱼胚胎的基因表达。与野生型胚胎相比，THOR-/-斑马鱼胚胎中IGF2BP1靶标的表达降低，并且在过表达的h-THOR的斑马鱼胚胎中igf2a和igf2b的表达增加（图7E）。此外，为了进一步研究THOR的体内功能，我们制备了斑马鱼黑色素瘤模型，该模型采用胚胎注射由mitfa启动子（黑素细胞中表达的斑马鱼基因）驱动的人NRAS-K61，形成易于看见的斑马鱼黑色素瘤（图7A）。使用这种NRAS黑素瘤系统，我们观察到THOR-/-斑马鱼对黑色素瘤形成的显着抗性（图7F）。值得注意的是，虽然之前的斑马鱼黑色素瘤NRAS61K模型需要p53突变体背景来进行肿瘤发生，但我们在单细胞胚胎中注入大量NRAS61K/Tol2时观察到p53野生型斑马鱼的肿瘤生长（5 ng / uL）。我们在p53野生型环境中产生肿瘤的能力可能是由于F0斑块现象和Tol2系统转基因效率的提高。THOR介导的受精缺陷和对黑色素瘤的抗性为THOR在脊椎动物生理学和病理生理学中的保守作用提供了令人信服的证据。
8 人类THOR增强斑马鱼黑色素瘤形成
为了进一步研究THOR在斑马鱼黑色素瘤发展中的作用，我们利用mitfa启动子驱动的注射方法，注射mCherry作为阴性对照，评估了人类THOR添加到斑马鱼胚胎中的功能（图7G）。对p53敲除（p53-/-）斑马鱼进行注射以增强如前所述观察到的黑素瘤表型。在该模型中，胚胎注射较低浓度的NRAS61K / Tol2（2.5ng / uL）与THOR敲除模型相比（图7A和7F），导致更弱的表型（图7H），尽管p53丢失。然而，我们研究表明在THOR过表达的情况下p53的缺失显着降低了tumor-free存活率（图S7B）。斑马鱼中h-THOR的过表达足以显着增加黑素瘤发展的产生（图7H），但也显着增加黑素瘤肿瘤的大小（图7I和7J）。在p53-/-和野生型斑马鱼（图7J，S7I和S7K）中NRAS 61K诱导的黑素瘤对Melan-A（人类标本中的mitf靶基因和黑素瘤标记物）染色呈阳性，证实病变实际上是黑素瘤（图S7J和S7L）。因此，人类同源转录本THOR促进斑马鱼黑色素瘤的显着能力证明了THOR在介导可能参与肿瘤发展中的进化保守作用。
4 讨论
我们发现第一个癌症/睾丸lncRNA，THOR鉴定为具有癌症/睾丸表达模式的lncRNA，其表现出与IGF2BP1的保守相互作用，可能促进肿瘤发生。我们定义了一类新的lncRNA，可以提供对癌症生物学理解的深入了解，并且与其他癌症/睾丸抗原一致，这一新的lncRNA可能为未来的癌症治疗方法的发展提供潜力。 lncRNAs在人类转录本中非常丰富，但对于大多数lncRNA在细胞中起作用的方式知之甚少。因此，在本研究中，我们旨在定义一类新的lncRNA，并对其在细胞中的功能相关性进行彻底调查。因此，我们实施了重要的进化保守分析，THOR（图1A和1B）的选择标准，以便利用动物模型强有力地研究其在细胞中的作用。通过在人类，小鼠和斑马鱼中观察到的睾丸特异性组织表达模式，THOR呈现出具有进化保守功能的可能性，增强了其在许多脊椎动物物种中发挥重要作用的可能性（图2A，2C和2D）。其他有趣的癌症/睾丸lncRNA可能不存在高度保守，并为未来的研究提供了一条令人兴奋的途径。为了达到确定THOR保守功能的目标，我们确定了人类和斑马鱼细胞中人类THOR和斑马鱼THOR的蛋白质结合相互作用（图4A）。该方法提供了一种有效的方法来鉴定THOR-IGF2BP1相互作用，因为它们在多种脊椎动物物种中是保守的。据报道，lncRNA与RNA结合蛋白（RBPs）的结合是普遍的，并且已经进行了多种研究来证实lncRNA-RBP相互作用。然而，在这项研究中，我们揭示了THOR与IGF2BP1的保守相互作用，这在以前没有报道过。虽然lncRNA序列和功能的保守性仍然是研究的一个活跃领域，但保守的lncRNA-蛋白质相互作用（例如THOR）的例子将有助于进一步促进我们对lncRNA的功能性理解。我们可以使用其他RNAi方法获得THOR敲除细胞系，能够证实的THOR介导的强大的功能表型。 CRISPR介导的敲除结果与RNAi基本一致，表明THOR的大部分功能是由RNA分子本身介导的，而不一定是其基因组位置。然而，CRISPR敲除结果和RNAi结果之间的微小差异可能是THOR基因座在转录本功能之外的另外作用的证据。
我们随后揭示THOR协助IGF2BP1调节多个mRNA靶标（图5A），可能通过调节IGF2BP1结合这些靶标的能力（图5B）并可能调节它们的转录稳定性（图S6E-S6I）。研究表明，这种THOR-IGF2BP1关系与THOR过表达观察到的癌症增殖表型有关（图5D和5E）。mRNA的转录后调节通过它们与各种RBP的相互作用而紧密控制。IGF2BPs几乎仅在细胞质的核周区域中观察到，其中它们与细胞质mRNPs中的靶mRNA结合并在mRNA调节中起重要作用。我们在这项研究中表明，THOR与IGF2BP1结合并调节广泛的靶mRNA稳定性。鉴于IGF2BP-RNA复合物在体外具有令人惊讶的长半衰期，THOR可能在促进''稳定''蛋白-RNA复合物形成中具有潜在作用，尽管进一步需要实验来确定精确的机制。值得注意的是，IGF2BPs已被证明主要定位于细胞质。因此，THOR的细胞质和核定位表明THOR在其与IGF2BP1相互作用之外的潜在功能。
虽然动物模型已被用于研究lncRNA，但我们首次对使用ze-brafish癌测定的致癌lncRNA进行了研究（图7A）。此外，许多这些先前的研究仅限于研究人类中很少组织表达的lncRNA。然而，THOR在多种物种中表达，并且在人类癌症中广泛表达（图3A），提高了它与我们对人类正常和疾病过程的理解的相关性。研究显示斑马鱼THOR的敲除导致异常受精（图7B和7C），此功能针对雄性睾丸，并且还显示THOR的敲除产生对黑素瘤形成的抗性（图7F），暗示z-THOR在斑马鱼中的功能。有趣的是，我们还表明，人类THOR能够利用斑马鱼细胞机制产生显着的癌症表型（图7H和7I）。 THOR的这种跨物种功能引起了人们的兴趣，表明它的序列和功能都是进化选择的。研究高度保守的lncRNA如THOR阐明了lncRNA发挥作用的关键机制，并且随着科学界继续研究大量未经研究的新型lncRNAs，这里提出的斑马鱼癌症模型系统提供了一个可以使用的强大平台用于进一步研究lncRNA功能。
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