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The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling
The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling
长链非编码RNA lncTCF7通过激活Wnt信号通路促进肝癌干细胞自我更新
期刊：Cell Stem Cell；影响因子：23.290
发表单位：中国科学院生物物理研究所
导读
lncRNA重要功能机制之一，可以发挥cis作用，调控临近基因表达。本研究发现肝癌干细胞基因间lncTCF7招募SWI/SNF复合物（染色质重塑复合物）与邻近基因TCF7（T细胞因子7）启动子结合，上调TCF7转录表达进而激活Wnt通路促进肝癌干细胞自我更新和维持。
1 摘要
Hepatocellular carcinoma (HCC) 是肝癌中最普遍的一种类型，具有高复发率和高异质性。肝细胞癌干细胞(CSCs)可能参与这些致病过程，但其自我更新和维持的机制并不清楚。本研究，使用转录组微阵列分析，我们鉴定了一个长链非编码RNA，命名为lncTCF7，在肝癌干细胞、肝癌肿瘤中高表达。lncTCF7在肝癌干细胞的自我更新和肿瘤进展中是需要的。机制上，lncTCF7可以招募SWI/SNF复合物结合到基因TCF7的启动子区调控TCF7的表达，引起Wnt通路激活。我们数据显示，lncTCF7介导的Wnt通路促进了肝癌干细胞的自我更新和肿瘤进展。总之，我们鉴定了基于lncRNA的Wnt通路调控，促进肝癌干细胞致癌活性，提示lncRNAs可以在肿瘤生长和扩散中发挥作用。
2 研究背景
肝癌是第五大最容易发生的癌，并在男性中致死率第二。肝细胞癌是肝癌中最普遍的癌，约占70%–85%。不幸的是5年生存率依旧很低，每年约有75万肝癌患者死亡。尽管以前在肝癌中鉴定到许多异常表达的基因，新的分子，但依旧需要继续新的诊断和风险评估分子。也需要增加对肝细胞癌致病机制的理解，以开发新的治疗方法。高复发和高异质性是肝癌的最大特点。近期研究显示异质性是干细胞/先祖细胞（肝癌干细胞）分层表达的结果。这种肿瘤组织中干细胞能够自我更新、分化、生成新的肿瘤，在不同分层中生成不同的癌细胞，引起高复发率。肝癌干细胞表面有许多markers如上皮细胞黏附分子 (EpCAM), CD133, CD13, CD90, CD44, CD24, 和钙通道a2d1亚基。然而，肝癌干细胞自我更新的机制仍不清楚。
lncRNAs是一类长度大于200nt的转录本部分具有5’帽子和3’polyA尾，但不能翻译蛋白。lncRNAs在多种生物学过程中发挥作用，可以通过机制以cis 或 trans方式调控基因表达。lncRNA参与多种生物学过程。癌中，报道称lncRNAs可以作为转录调控的重要分子，常与染色质重塑复合物合作。SWI/SNF是进化保守的一种多亚基复合物可以驱动核小体，利用ATP水解重塑染色质。SWI/SNF复合物与转录因子，激活因子，抑制因子结合调控基因的表达。许多癌中鉴定到SWI/SNF亚基抑制激活的突变，说明个别亚基的突变会促进癌的发生。而且SWI/SNF有报道能够控制哺乳动物干细胞哦自我更新和分化。但SWI/SNF复合物在肝癌干细胞中的作用研究较少。本研究，我们发现lncTCF7是胞癌干细胞自我更新和维持所需要的。lncTCF7可以招募SWI/SNF促进TCF7表达，引起Wnt通路激活，进而促进胞癌干细胞自我更新。
3 材料方法
1 细胞系和试剂
肝癌细胞系Hep3B, Huh7 and PLC/PRF/5由Dr. Zeguang Han提供。细胞培养在DMEM培养基上，并添加10%胎牛血清，100μg/ml，青霉素G，100 U/ml 链霉素。用到的抗体有藻红蛋白(PE)-anti-human CD133，PE-anti-human IgG，fluorescein isothiocyanate（异硫氰酸荧光素）(FITC)-anti-human CD13，FITC-anti-human IgG，兔anti-humanTCF7，兔anti-human BAF170，小鼠anti-human Sox2，小鼠anti-human BRG1 ，小鼠anti-human SNF5，兔anti-human CCND2，小鼠anti-human SNF5，兔nti-human CCND2，小鼠anti-human Ki67，小鼠anti-β-actin。
2 病人和样品收集
本研究招募37个肝切除术得到的原发肝癌病人，经验丰富的病理医生对肿瘤或活检组化进行诊断。14个肝硬化组织和8个正常肝组织用于对照。通过肝移植组化或CT/MRI结果诊断为肝硬化。所有组织样品已获准病人同意并得到伦理委员会允许。病人临床数据如Table S1。
3 肿瘤成球实验
细胞种植在超低吸附培养皿上，无血清培养。DMEM/F12无血清培养基包含2 mM左旋谷酰胺，1% 丙酮酸钠，100μg/ml 青霉素G，100 U/ml 链霉素，20 ng/ml上皮生长因子，10 ng/ml成纤维细胞生长因子2，N2，B27。肝癌干细胞生长在CO2温箱中1-2周。立体显微镜对肿瘤成球细胞进行计数。
4 流式细胞术与细胞分选
使用不同的抗体对细胞进行染色。FACSCalibur检测标记的细胞。对于细胞分选，藻红蛋白(PE)-anti-human CD133和异硫氰酸荧光素(FITC)-anti-human CD13与肝癌细胞或肝癌原代细胞，使用FACS Aria III进行分选。
5 HTA 2.0转录组微阵列实验
Trizol提取Hep3B, Huh7, and PLC/PRF/5肝癌细胞系CD133+CD13+ and CD133-CD13-细胞total RNA，并提取肝癌临床样品shCtrl和shlncTCF7肿瘤成球细胞。依据Affymetrix说明书对250ng total RNA使用Ambion® WT Expression Kit进行cDNA生物素标记。标记后，GeneChip Human Transcriptome Array 2.0微阵列与5.5ug cDN 45℃杂交16h。Affymetrix Fluidics Station 450冲洗GeneChips使其褪色。然后使用Affymetrix® GeneChip Command Console进行数据读取。Robust Multichip Analysis使用默认参数分析数据，数据进行log2转换。
6 RACE实验
使用Platinum Taq High-Fidelity聚合酶扩增RACE PCR产物，RACE引物如下5' RACE-outer: 5’-CCATCCTGGCTGAACTTTGG -3’, 5' RACE-inner: 5’-TGGACCTGAGCTAACTCCTG-3’; 3' RACE-outer: 5’-CACATGTAGGGGGTACCTTC-3’; 3' RACE-inner: 5’-GGAACACAGTGGCGCACAGG-3’。1.5%琼脂糖凝胶RACE PCR产物分离。Gel Extraction kit提取分析产物，克隆入pMD18-T载体中，M13 forward and reverse primers进行双向测序。
7 shRNA干扰
MIT's siRNA designer (http://sirna.wi.mit.edu/home.php) 设计针对于lncTCF7, TCF7 and BAF170的shRNAs。每个基因设计4条，效率最高的shRNAs用于后续分析。序列如下：lncTCF7 1#: 5'-AGCCAACATTGTTGGTTAT-3', 2# 5'-CACCTAGGTGCTCACTGAA-3'; TCF7: 5'-ATGCTGTACATGAAGGAGA-3'; BAF170: 5'-CAAACTACTAGGGAAATTA-3'。lncTCF7, TCF7, BAF170的shRNA及对照发夹克隆入pSICO R载体。依据RNAi consortium (http://www.broadinstitute.org/rnai/trc) 说明书将慢病毒载体转染到肝癌干细胞中。培养细胞24h，嘌呤霉素处理5天筛选阳性细胞，而后收集细胞进行蛋白质或RNA分析。
8 lncTCF7过表达分析
将lncTCF7 cDNA全长克隆入pCDNA3.1载体，按照之前的方法转染到细胞。G418挑选稳定的克隆，DNA测序确认。
9 裸鼠肿瘤异种移植实验
不同浓度contrl和treated细胞皮下注射到裸鼠(male BALB/c nude mice) ，小鼠年龄4-6周，两边后背侧区均有支架。(n=6 to 12每组) 。每隔一天测量肿瘤大小。小鼠在标准环境下饲养。
10 免疫印记分析
在有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解细胞。 通过SDS-PAGE分离细胞质或核蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将其与一抗孵育，然后与辣根过氧化物酶结合的二抗孵育。化学发光系统显示信号。
11 RNA免疫沉淀（RIP）和染色质免疫沉淀（ChIP）测定
使用Millipore EZ-Magna RIP RNA-binding protein immunoprecipitation kit进行RIP测定。简而言之，按照之前描述过（Rinn et al., 2007）使用total RNA作为对照，通过qRT-PCR分析RIP产物。每次qRT-PCR反应使用了1/150体积的RIP RNA产物。每次RIP反应使用5抗体。如前所述（Xia et al.，2013）进行了ChIP实验。qRT-PCR定量ChIP富含的TCF7启动子，使用以下引物：F：5'-GAGGGAGAGGCGTCCAATAC-3'，R：5'-GCTCCCCTAGCAGGTTTCTG -3'。
12 定量实时PCR（qRT-PCR）测定
根据说明使用书使用TRIzol和RNeasy试剂盒分离total RNA，DNase I进行消化。使用M-MLV逆转录酶和随机引物从total RNA中合成cDNA。qRT-PCR在ABI7300实时PCR系统（ABI 7300，Applied Biosystems）进行。18S或β-actin作为内参。
13 DNase I消化测定
分离细胞核并裂解用于DNase I消化测定。在37℃下消化5分钟后，提取total DNA以进行qPCR，用如上所述的TCF7启动子特异性引物进行测定。
14 肿瘤增殖细胞（TPCs）相对频率分析
使用极端有限稀释法(ELDA) 来估计TPC的相对频率（ELDA）软件（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）。卡方检验获得统计p值。
15 Northern Blot分析
按照Wang et al., 2013b方法提取肝癌干细胞和对照细胞的total RNA，进行Northern Blot分析。lncTCF7 特异性的DNA序列(nt320–683) 克隆入pcDNA4/mychis B 载体。使用CTP (Perkin Elmer)和Riboprobe体外转录标记系统产生363nt放射性RNA探针。
16 RNA-FISH
荧光标记的lncTCF7探针用于RNA-FISH。使用DNA probe sets进行探针杂交。FV1000共聚焦显微镜观察实验组和对照组细胞。
17 RNA Pull-down 和质谱分析
按照Klattenhoff et al., 2013 报道的方法进行RNA Pull-down。生物素标记试剂盒，T7 RNA polymerase，DNase I ，产生生物素标记的RNA（lncTCF7，他的反义RNA，及来源于lncTCF7内含子区的两个对照），RNeasy Mini Kit纯化。肝癌干细胞细胞核提取，与生物素标记的RNA孵育，pulldown蛋白SDS-PAGE凝胶电泳，质谱分析。
18 RNA-EMSA实验
LightShift Chemiluminescent RNA EMSA Kit进行EMSA实验。上调的信号以BAF170的表达量为参照，使用GraphPad Prism 6绘Figure 。
19 统计分析
SPSS 13.0，GraphPad Prism 6 使用双尾Student’s t检验进行分析，致瘤频率使用(ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)计算，p < 0.05认为有统计学意义。
4 结果
1 肝CSCs lncTCF7高表达
虽然CD13和CD133已被广泛用作肝CSC表面标志物，HCC细胞系或HCC原发样品中，单独的CD133或CD13可以富集更多的细胞群（Figures S1A and S1B）。Haraguchi et al. (2010) 证明了部分CD13+ CD133+细胞与其对应的CD13-CD133-相比表现出缓慢的生长。此外，相比CD13-CD133-细胞亚群，部分CD13 + CD133 +细胞对化学药物治疗具有高度抗性。值得注意的是，我们观察到在9种HCC细胞系七种成功富集到CD13 + CD133 +细胞亚群，我们检查了30个HCC原发样品（Figure S1B），超过90％富集到CD13 + CD133 +细胞亚群。因此，我们结合CD13和CD133富集CD13 + CD133 +细胞，鉴定为肝CSCs，用于本研究。
然后我们对CD13 + CD133 +细胞进行了分选，Hep3B，Huh7和PLC/PRF/5 HCC细胞系鉴定为肝CSCs。实际上，来源于Hep3B细胞CD13 + CD133 +亚群，相比CD13-CD133-细胞显著增强的肿瘤成球形成（10.3％±1.3％对2.6％±0.3％; p =0.003）（Figure S1C）。另外，肿瘤球形成频率来源于Hep3B细胞 CD13 + CD133 +和CD13 + CD133-亚群为10.3％±1.3％对6.1％±1.1％（p =0.0253）; CD13 + CD133 +与CD13-CD133 +相比分别为10.3％±1.3％对5.2％±1.3％（p = 0.0226）（Figure S1C）。Huh7和PLC/PRF/5 HCC细胞系获得了类似的观察结果（Figure S1C）。来自Hep3B细胞的CD13 + CD133 +亚群的成瘤能力细胞明显高于单个CD13 +或CD133 +细胞亚群（Figure S1D和S1E）。Huh7细胞结果类似。我们得出结论，肿瘤的致瘤能力CD13 + CD133 +细胞亚群远高于单个CD13 +或CD13 +细胞亚群。值得注意的是，细胞周期分析（Figure S1F）发现CD13 + CD133 +细胞与CD13-CD133-细胞增殖能力没有显著差异。为了鉴定参与肝CSCs的lncRNA，我们对CD13 + CD133 +细胞（以下简称称为肝CSCs）、CD13-CD133-细胞（non-CSCs）进行了转录组微阵列分析。与non-CSCs相比，286个非编码RNA转录物在肝CSCs中异常表达（Figure 1A），我们随机选择10个差异lncRNAs在肝CSCss中进行了验证（Figure S1G）。
由于lncRNA可以顺式作用调节邻近基因的表达或通过多种机制反式调节其他基因表达，我们专注于基因间lncRNAs，它们在肝CSCs中高表达并在干细胞转录因子附近，这些干细胞转录因子是蛋白编码基因可以影响干细胞信号通路。在这些高表达的基因间lncRNAs中，我们专注于一个未鉴定的lncRNA，称为lncTCF7（gene symbol TCONS_00009511-XLOC_004555）。 lncTCF7是肝CSCs中表达最高的lncRNA之一(Figure 1A and Figure S1G) 。位于5号染色体上，为热休克70kDa蛋白4（HSPA4）和T细胞因子7（TCF7）之间。 lncTCF7由三个外显子组成和跨越近3.6千碱基（kb），是中度保守的基因位点。我们进一步证实了lncTCF7在肝CSCs中高度表达（Figure 1C），以及在源自HCC细胞系和HCC原发样品的肿瘤成球细胞中表达（Figure 1D和1E）。我们接下来检查了一组37对配对HCC肿瘤和肿瘤周围组织，以及14种乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝硬化组织和8个正常肝组织（table S1）。我们观察到lncTCF7在HCC肿瘤（Figure 1F和Figure S1H）和HCC细胞中显著高表达（Figure S1I）。而肝硬化样本和健康肝组织几乎检测不到（Figure 1F和Figure S1H）。此外，lncTCF7在其他一些原发组织无法检测到（Figure S1J），提示lncTCF7有严格限制的表达模式。
我们进一步通过northern印迹检查了肝CSCs中lncTCF7的转录本。肝CSCs中只有一种lncTCF7的转录变体，长度在500到1,000个碱基之间（Figure 1G）。然而，non-CSCs中lncTCF7表达低得多。RACE测定lncTCF7转录物cDNA（Figure S1K）总长度为683nt的，没有显示编码潜力（Figure S1L和S1M）。此外，通过RNA荧光原位杂交（RNA FISH）和细胞组分分析（Figure 1H和1I）lncTCF7定位于HCC肿瘤的细胞核中。lncTCF7在肿瘤成球细胞中高表达，在非成球细胞中表达很差。这些数据表明lncTCF7，作为lncRNA，在HCC肿瘤组织和肝CSCs中高度表达。
2 lncTCF7是肝CSCs自我更新维持所必需的。
为了确定lncTCF7在肝CSCs自我更新中的作用，我们使用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNAs）将肝CSCs中lncTCF7外显子1或3（Figure 2A）沉默。shRNA-2（针对外显子3）获得更高的敲低效率。值得注意的是，与对照（shCtrl）细胞比较，lncTCF7敲低显著降低了多能转录因子Sox2，Nanog，Oct4的表达（Figure 2B）。相反，lncTCF7敲低不影响cMyc表达。实际上，c-Myc在lncTCF7沉默和shCtrl中均高表达，其表达在loss-of-function实验中没有显著改变（Figure 2B）。另外，lncTCF7敲低显著减少了CD13 + CD133 +细胞（CSC）部分的产生（Figure 2C）。重要的是，lncTCF7敲低显著降低了HCC细胞系和HCC原代细胞的初级，第二和第三瘤球形成（Figure 2D）。
lncTCF7沉默也减弱了初级成瘤细胞的第二和第三次瘤形成。在lncTCF7沉默的PLC/PRF/5细胞中获得了类似的观察结果（数据未显示）。因此，HCC原发性肿瘤细胞中的lncTCF7敲低显著降低了Sox2和Nanog的表达（Figure 2E）。更重要的是，我们对源自HCC细胞系和原代样品的CD13 + CD133 +细胞亚群进行了第2代和第3代异种移植肿瘤生长实验。我们注意到来自第2代和第3代的CD13 + CD133 +细胞群显示出更强的肿瘤起始能力（Figure S2A）和肿瘤球形成能力（Figure S2B），表明CD13 + CD133 +细胞群的长期自我更新能力。此外，与non-CSC相比，肝CSCs中的Ki67信号没有明显改变（Figure S2C）。然而，在肝CSCs中Sox2的量显著增加，但在non-CSC中则没有。相比之下，与空载体处理的细胞相比，lncTCF7过表达显著增强肝CSCs中的Sox2信号，而过表达lncTCF7的CSCs中Ki67信号没有改变。在异种移植肿瘤中获得了类似的观察结果（Figure S2E），表明lncTCF7介导的肝癌致瘤性主要由CSCs的自我更新能力引起。
我们接下来探讨了lncTCF7在肿瘤起始形成中的作用。我们使用稳定敲低了lncTCF7和shCtrl细胞皮下注射BALB/c裸鼠。通过有限稀释异种移植（limiting dilution xenograft analysis）分析与shCtrl原发性肿瘤细胞相比较，lncTCF7敲低导致肿瘤存在更弱（Figure 2F），表明lncTCF7敲低降低了肿瘤起始形成能力。此外，lncTCF7敲低显著抑制异种移植肿瘤生长和致瘤细胞频率（Figure 2G和2H）。我们观察了4个月的异种移植生长，并确定肿瘤可检测性的阈值肿瘤大小为30-40立方毫米。 在lncTCF7沉默的HCC细胞系中观察到了类似的结果（Figure S2F-S2H）。 总之，lncTCF7沉默减弱了肝CSCss的致瘤能力。
3 lncTCF7过表达增强肝CSCs的致瘤能力
我们接下来在HCC原发性肿瘤细胞和细胞系中过表达lncTCF7，并建立lncTCF7稳定过表达的细胞系（Figure 3A和Figure S3A）。lncTCF7过表达显著增加多能转录因子的表达（Figure 3B）。值得注意的是，lncTCF7过表达显著增强了瘤成球和肿瘤起始形成能力（Figure 3C和3D）。同样，lncTCF7过表达显著增加了异种移植肿瘤生长（Figure 3E）和致瘤细胞频率（Figure 3F）。我们至少检测了6个HCC初级样品均获得类似的观察结果。在lncTCF7过表达的HCC细胞系如Hep3B和Huh7细胞中也观察到类似的结果（Figure S3）。总之，这些数据表明lncTCF7在肝CSCs的自我更新维持中起关键作用。
4 lncTCF7促进TCF7表达激活Wnt信号
为了探索lncTCF7的靶基因，我们建立了lncTCF7沉默的HCC原代CSC细胞并进行了转录组微阵列分析。lncTCF7敲低导致2,491个基因的差异表达（Figure S4A），表明lncTCF7调节许多与重要信号传导过程相关的基因，包括Wnt信号传导途径（Figure S4B）。显然，lncTCF7敲低显著降低了其附近的蛋白质编码基因TCF7和一些主要的Wnt信号靶标（Figure 4A）。相比之下，HSPA4和其他相邻基因没有显示出显著变化。然后，我们在HCC细胞系（Hep3B，Huh7和PLC）或HCC原代细胞（至少六个样品）中验证了这些结果。一致地，lncTCF7沉默显著降低了TCF7和主要Wnt靶标的表达（Figure 4B和4C以及Figure S4C和S4D）。相比之下，lncTCF7敲除不改变HSPA4和其他相邻基因的表达（Figure S4C和S4E）。此外，HCC细胞系或HCC原代细胞中的lncTCF7过表达显著增强了TCF7和主要Wnt靶标的表达（Figure S4F）。这些数据表明lncTCF7激活HCC中的Wnt信号传导途径。
我们通过定量实时PCR进一步检测了HCC受试者中lncTCF7和TCF7的表达水平。我们注意到lncTCF7表达与TCF7的表达正相关（Pearson相关系数r = 0.693，p <0.001）（Figure 4D）。为了确定lncTCF7在肝CSCs自我更新的调节中是否在TCF7的上游起作用，我们在lncTCF7沉默的HCC细胞中高表达TCF7（Figure 4E）。有趣的是，TCF7恢复挽救了由lncTCF7敲除减少的瘤形成能力（Figure 4F）。此外，TCF7恢复还挽救了lncTCF7敲低减少的肿瘤起始能力和异种移植肿瘤生长（数据未显示）。 lncTCF7沉默显著下调一些主要Wnt分子的表达，包括Wnt7a，Wnt4和Wnt2b（Figure 4A和4B）。在这三种Wnt分子中，lncTCF7敲低降低最多的是Wnt7a的表达。为了进一步验证Wnt7a是否是lncTCF7的下游效应子，我们将lncTCF7沉默的HCC原发CSCs与重组Wnt7a一起孵育用于瘤球形成测定。我们发现Wnt7a恢复了由lncTCF7消耗减少的瘤球形成能力（Figure S4G）。另外，Wnt7a还恢复了lncTCF7敲低的HCC原代CSC中TCF7，Sox2和Nanog的表达水平（Figure S4H）。据报道，DKK1（Dickkopf相关蛋白1）是Wnt信号传导的细胞外抑制剂。DKK1的存在能够消除由lncTCF7过表达引起的瘤球形成能力（Figure S4I）。一致地，DKK1处理还阻碍了过表达lncTCF7的HCC初级CSC细胞中TCF7，Sox2和Nanog的表达水平（Figure S4J）。这些数据表明lncTCF7促进TCF7表达维持肝CSCs的自我更新。
为了进一步探讨TCF7在HCC中的临床意义，我们分析了TCF7在HCC肿瘤和肿瘤周围组织中的表达。我们观察到TCF7在HCC肿瘤中高度表达（Figure 4G）。另外，TCF7主要定位于HCC瘤细胞的细胞核中，而在非瘤球细胞中几乎检测不到（Figure 4H）。通过免疫组织化学染色进一步证实了HCC样品中TCF7的高表达（Figure 4I）。重要的是，TCF7的高表达病人的5年生存率较低（Figure 4J）。接下来，我们在HCC细胞中沉默TCF7并建立稳定沉默的细胞系（Figure 4K）。值得注意的是，TCF7敲低抑制了Sox2的表达。我们观察到TCF7沉默显著减少了HCC细胞系和原代细胞中的球囊形成，肿瘤起始能力和异种移植生长（Figure 4L-4N，和数据未显示）。总之，lncTCF7启动TCF7表达以激活Wnt信号传导途径，导致肝CSCs自我更新和肿瘤传播的引发。
5 lncTCF7招募SWI/SNF综合体
lncRNA可以通过RNA相互作用蛋白发挥其功能，通过各种机制调节基因表达（Geisler和Coller，2013）。因此，我们用生物素标记的lncTCF7进行RNA pull-down测定，以寻找潜在的lncTCF7相关蛋白。鉴定了SWI/SNF复合物的三个核心亚基BRG1，BAF170和SNF5在肝CSCs中结合lncTCF7（Figure 5A和5B以及Figure S5A-S5C）。通过RNA免疫沉淀（RIP）进一步验证了lncTCF7与三种SWI/SNF组分的相互作用（Figure 5C和Figure S5D）。然而，lncTCF7敲低不影响BAF170，BRG1和SNF5的表达水平（Figure 5D），表明lncTCF7不参与SWI/SNF复合物的转录后后调节。此外，lncTCF7在HCC瘤球细胞的细胞核中与BAF170共定位，而lncTCF7在非瘤球细胞的细胞核中表达很少（Figure 5E）。这些数据表明lncTCF7与肝CSCs细胞核中的SWI/SNF复合物相关。我们接下来构建了一系列lncTCF7片段，以将其结合片段与SWI/SNF复合物进行结合。我们发现lncTCF7的3’端片段（nt 468至683）高效结合BAF170，BRG1和SNF5（Figure 5F）。通过RNA折叠分析预测3’端片段的稳定茎环结构（Figure S5E）。通过RNA电迁移率变动分析（EMSA）进一步证实了lncTCF7的3’末端区域与BAF170的结合（Figure 5G和5H）。未标记的lncTCF7探针竞争性地破坏了这种结合能力。另外，lncTCF7显示高结合亲和力（解离常数[Kd] 36.24nM）（Figure 5I）。这些数据表明lncTCF7以高亲和力直接结合SWI/SNF复合物。
6 lncTCF7促进TCF7表达以激活Wnt信号
鉴于SWI/SNF复合物通过与基因启动子结合并重折叠染色质来调节基因转录，然后我们检测lncTCF7是否影响TCF7基因启动子与BAF170结合。我们分析了TCF7基因的转录起始位点（TSS）上游的3kb基因座。我们发现lncTCF7敲除减少了BAF170与（大约）~1,160至~1048bp的TCF7启动子区段的结合能力（Figure 6A），表明该区段是lncTCF7的结合位点。通过荧光素酶报告分析，我们鉴定到（大约）1,200至约1,100bp的TCF7启动子区段作为BAF170的高效结合位点（Figure 6B-6D）。最后，我们通过DNA酶I消化测定法观察到lncTCF7或BAF170敲低显著减弱了TCF7基因座的染色质可塑性（Figure 4E）。相比之下，染色质免疫沉淀（ChIP）分析（Figure S6A-S6D）评估，BAF170未能在干细胞多能因子的启动子上募集，表明BAF170对干细胞多能因子的表达是间接作用。这些数据表明lncTCF7募集SWI/SNF复合物到TCF7启动子，从而导致其活化。
值得注意的是，SWI/SNF复合物在HCC肿瘤和肝CSCs中高度表达（Figure 6F和数据未显示），表明SWI/SNF复合物可能涉及肝CSCs自我更新的调节。因此，BAF170敲低显著降低了TCF7和Nanog（Figure 6G）以及Wnt下游靶标（例如Sox2，CCND1和CCND2）的表达。此外，BAF170敲低显着减弱了HCC细胞系和HCC原代细胞的瘤形成能力（Figure 6H）。最后，BAF170敲低还显著降低了肿瘤起始能力和异种移植肿瘤生长（Figure 6I-6K）。通过敲低SNF5和BRG1观察到类似的结果（数据未显示）。总之，我们的数据显示lncTCF7通过募集SWI/SNF复合物促进TCF7表达，启动肝CSCs的自我更新和肿瘤起始。
5 讨论
最近，已经在许多实体瘤中鉴定出CSCs，包括乳腺癌，肺癌，肝癌，脑癌，结肠癌，前列腺癌和膀胱癌。CSCs具有干细胞特征，例如自我更新和分化。由于其侵入性和耐药性，CSCs可以解释癌症复发和转移。已经在肝CSCs中鉴定了几种表面标志物。然而，肝CSCs生物学的细节仍然很大程度上未知。在该研究中，我们从HCC细胞系和HCC原代细胞中分离了CD13 + CD133 +细胞亚群，并将它们鉴定为肝CSC。通过转录组微阵列分析，我们在肝CSCs中鉴定了286个差异表达的非编码RNA。在这些高表达的肝CSCs中的lncRNA中，我们定义了一种称为lncTCF7的lncRNA，其在引发肝CSCs的自我更新中起关键作用。
据报道，lncRNA在基因调控和其他细胞过程中发挥着广泛的作用。lncRNA通过多种机制发挥其功能，包括共转录调节，基因表达的调节，参与核或细胞质复合物，以及与其他RNA的配对。值得注意的是，许多证据表明lncRNA作为表观遗传修饰物调节基因表达。在这里，我们发现lncTCF7通过募集SWI/SNF复合物顺式激活TCF7表达。TCF7表达促进Wnt信号传导以启动肝CSCs的自我更新。尽管lncTCF7以反义方向表达，但它不能形成用于调节TCF7表达的lncTCF7-TCF7 mRNA复合物。Wnt信号在CSCs的自我更新和分化中起关键作用。Wnt信号传导的异常激活与肝癌和其他慢性肝病有关。本研究数据显示TCF7和Wnt下游靶基因下调减弱肝CSCs的自我更新及其肿瘤起始能力，表明TCF7介导的Wnt信号传导对于维持肝CSCs自我更新和致瘤性是至关重要的。
CSCs具有自我更新和分化的干细胞特性。在本研究中，我们发现通过细胞周期分析和免疫荧光染色分析，肝CSCs和non-CSC之间的增殖能力没有显着差异。实际上，CSCs主要存在于具有休眠或缓慢生长特性的G1/G0期或G0期。因此，可能难以通过Ki67染色或通过碘化丙啶（PI）测定的DNA含量来区分肝CSCs和non-CSCs之间的增殖差异。而且，不同癌症类型的自我更新特性可具有不同的增殖特征。维持自我更新是一个极其复杂的生物过程，由表观遗传状态，多能转录因子，表观遗传复合物和许多发育通路调控。我们的数据支持这样的观点，即肝CSCs中lncTCF7介导的Wnt信号传导激活在肝CSCs自我更新的调节中起关键作用。
TCF7作为T细胞因子，以其在T淋巴细胞发育和多能造血细胞自我更新中的功能而闻名。TCF7可以启动Wnt信号作为上游触发器。TCF7-/-小鼠发生肠和乳腺腺瘤，暗示TCF7在肿瘤抑制中的作用。在本研究中，我们证明TCF7是肝CSCs自我更新和肿瘤增殖所必需的，并且充当肿瘤启动子。TCF7受肝CSCs中的lncTCF7调节，以激活Wnt信号通路，从而引发肝CSCs的自我更新。最近的一项研究报道，TCF7在胚胎干细胞衍生的视网膜祖细胞的眼移植后作为肿瘤发生的肿瘤增强剂发挥作用。总的来说，我们的研究结果揭示了lncTCF7介导的TCF7表达，启动了Wnt信号传导。促进肝CSCs的自我更新和作为肝肿瘤启动子增强致瘤性。 CSCs类似于组织特异性干细胞，因为它们有助于长期生长并且负责肿瘤的维持和生长。转录调控是决定细胞命运的关键调控机制之一，其中包括顺式调控元件和反式作用因子。在所有反式因子中，染色质重塑调控在基因转录中起关键作用，并依赖于ATP-依赖的染色质重塑复合物。SWI/SNF复合物由12-15个亚基组成，其中含有两个催化ATP酶亚基之一，SMARCA4/BRG1或SMARCA2/ BRM，以及几个核心成分，如SMARCB1/SNF5，BAF170和BAF155 。SWI/SN复合物通过动员核小体调节基因表达，并利用ATP水解的能量重塑染色质，表明其在基因表达中的关键作用。几种SWI/SNF亚基中的失活突变引起各种人类癌症，表明一些组分充当肿瘤抑制剂。最近的一项研究报道，长非编码RNA SChLAP1与SNF5亚基结合，通过拮抗SWI/SNF复合物的功能来促进前列腺癌的进展，这意味着SNF5起肿瘤抑制剂的作用。在这里，我们发现lncTCF7可以募集SWI/SNF复合物以启动TCF7表达，从而引发肝CSCs自我更新。此外，我们观察到BAF170，BRG1和SNF5在HCC标本和肝CSCs中高度表达，其敲低减弱肿瘤起始能力和肿瘤增殖（Figure 6，数据未显示），表明这三种成分充当肿瘤促进剂。因此，SWI/SNF复合物组分如何在肿瘤发生中起作用仍有待进一步研究。
总之，lncTCF7可通过将SWI/SNF复合物募集到TCF7启动子，通过激活Wnt信号传导来促进肝CSCs自我更新和肿瘤增殖。我们的研究结果表明，lncRNA可以作为肿瘤发生的另一种调节分子。
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