Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression

circRNA MTO1作为miRNA海绵与miR-9结合抑制肝癌进展

    期刊：Hepatology；影响因子：11.711

    发表单位：浙江医科大学

    circMTO1通过作为miR-9的海绵来促进p21表达以抑制HCC进展。

    我们分析了人类circRNA在人类肝细胞癌（HCC）组织中的表达谱，并鉴定circMTO1作为在HCC组织中显著下调的一种circRNA。具有低circMTO1表达的HCC患者存活期缩短。通过使用生物素标记的circMTO1探针在HCC细胞中进行RNA体内沉淀，我们将miR-9鉴定为circMTO1相关的miRNA。此外，HCC中circMTO1的沉默可以下调致癌miR-9的靶标p21，从而促进HCC细胞的增殖和侵袭。

    肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，尤其是在中国。只有30％至40％的HCC患者使用与治愈性切除术，部分原因是症状晚期出现，并且由于转移、复发的频率高，这些HCC患者的预后仍然较差。这些挑战使得迫切需要识别用于预后预测的潜在生物标志物并找到设计更强大治疗方法的新靶标。在过去十年中，已发现许多非编码RNA在HCC患者中失调，在临床中具有潜在应用。然而，HCC中circRNA的表达谱，功能和失调仍有待鉴定。

    使用CircRNA microArray分析了7对HCC组织样品，得到HCC和非肿瘤肝组织的circRNA表达谱。接下来，选择10个上调和10个下调最显著的circRNA在21个患者样本中进行验证发现circMTO1表达持续且显著降低，然后在另外261例HCC患者中得到了验证。与匹配的非肿瘤组织相比，在87.4％HCC组织中circMTO1表达显著降低。虽然一些circRNAs在HCC组织中减少，初步结果显示对HCC细胞生长没有显著影响，并且只有circMTO1的沉默对促进HCC细胞增殖具有显著作用。取116名HCC患者的样本进行原位杂交分析确定circMTO1表达，与癌旁组织相比，HCC组织中的circMTO1表达也显著降低，并且生存曲线显示circMTO1低表达与HCC患者预后不良显著相关。

    通过MiRanda计划预测，99个miRNA被预测为的目标，然后筛选了表达和功能与HCC有关的20种circRNA，通过RIP circMTO1下拉实验，我们纯化了circMTO1相关RNA并分析了该复合物中的20种候选miRNA。与对照相比，circMTO1和miR-9的特异性富集，而其他miRNA没有富集，确定miR-9是HCC细胞中与circMTO1相关的miRNA。通过在HCC肿瘤和对照组中的FISH分析，我们发现circMTO1与细胞质中的miR-9共定位，并且与匹配的非肿瘤组织相比，这种共定位在肿瘤中降低。

    构建siRNA，其覆盖了circMTO1的背面剪接区域以进行沉默并通过qPCR确认沉默效率。circMTO1同种型2和MTO1 mRNA的表达没有显示出显著变化，证实了circMTO1沉默的特异性。此外还构建了circMTO1过表达质粒。circMTO1沉默显著促进HepG2和SMMC-7721细胞的细胞增殖，增强细胞侵袭和减少凋亡，而circMTO1过表达促进QGY-7701和SK-Hep1 HCC细胞的细胞凋亡。检测了miR-9表达，发现circMTO1对miR-9的表达水平没有影响。因此，这些结果表明circMTO1可能通过海绵活性降低miR-9的致癌作用来抑制HCC进展。

    circMTO1的沉默或miR-9模拟物的转染均显著降低HCC细胞中p21的mRNA和蛋白质表达水平。此外，circMTO1的过表达可以增加QGY-7701和SK-Hep1 HCC细胞中p21的mRNA和蛋白质表达水平。在沉默circMTO1后，miR-9抑制剂可显著降低p21 mRNA和蛋白质表达的下调。更重要的是，miR-9抑制剂显著阻断了HCC细胞的circMTO1沉默介导的促进增殖和细胞凋亡的抑制。因此，miR-9抑制剂可以阻断circMTO1沉默的HCC促进作用。结果表明circMTO1为miR-9的海绵，通过circMTO1/miR-9/p21轴消除miR-9致癌作用抑制HCC进展。

    通过移植人HCC组织在裸鼠中形成皮下肿瘤并持续皮下传代来制备携带HCC的裸鼠（SMMC-LTNM）。连续瘤内注射胆固醇缀合的circMTO1 siRNA 2周后，我们发现在携带HCC的SMMC-LTNM小鼠中肿瘤生长显著加速并且血清AFP显著增加。在肿瘤内注射胆固醇缀合的circMTO1 siRNA后48小时，SMMC-LTNM小鼠的肿瘤组织中circMTO1和p21的表达显著降低。此外，p21和下游CDK2表达被体内circMTO1敲低抑制，而细胞侵袭和增殖标志物MMP2和PCNA被上调。因此，这些结果证明circMTO1可以抑制体内HCC进展。

    总之，我们的研究结果表明，HCC中circMTO1表达显著降低，并与HCC患者预后不良相关。功能和机制上，circMTO1通过对miR-9的海绵活性上调p21表达抑制HCC生长，表明其在HCC发展中的肿瘤抑制作用。此外，circMTO1的体内干预表明其在HCC靶向治疗中的潜力。

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