CircNT5E acts as a sponge of microRNA-422a to promote glioblastoma tumorigenesis

CircNT5E充当microRNA-422a的海绵，以促进胶质母细胞瘤的肿瘤发生

    期刊：Cancer Research；影响因子：9.130

    发表单位：创伤性脑损伤与神经病学研究所

    之前我们介绍了circRNA作为海绵吸附miRNA发挥作用如《circRNA过表达可以抑制HCC（ceRNA机制）》、《circRNA过表达可以导致心肌死亡（ceRNA机制）》、《circRNA可用作miRNA海绵促进肿瘤的生长和转移（IF: 9.130）》，本研究发现胶质母细胞瘤中circNT5E可以海绵吸附miR-422a，通过影响miR-422a-NT5E、SOX4和PI3KCA通路促进胶质母细胞瘤细胞增殖，迁移和侵袭等。

    我们确定了miR-422a下调的胶质母细胞瘤组织中特异性增加的circRNA和lncRNA的子集。表征了来自NT5E的circRNA，命名为circNT5E。circNT5E控制多种病理过程，包括细胞增殖，迁移和侵袭。circNT5E直接结合miR-422a并抑制miR-422a活性。

    胶质母细胞瘤（GBM）是众所周知的中枢神经系统最常见的原发侵袭性恶性脑肿瘤，也是人类最致命的致癌形式之一。在最大可行的手术切除后，接受放疗和替莫唑胺化疗的患者显示平均总生存期约为15个月。因此，GBM迫切需要新的治疗方法，特别是那些靶向复杂基因调控网络的方法。

    首先，我们分析3对GBM组织样品证实MiR-422a表达低于正常脑组织，然后进行微阵列（circRNA，lncRNA和mRNA）测定，qRT-PCR验证。图1A显示了不同染色体中上调和下调的circRNA，lncRNA和mRNA的概述。548个circRNA/lncRNA上调。筛选miR-422a调节的ceRNA的流程如图1C。结合阵列数据，TargetScan预测，得到355个circRNAs/lncRNAs可作为miR-422a海绵。具有miR-422a的两个或更多个靶位点鉴定了38个circRNA/lncRNA。我们通过使用生物素-miRNA下拉法测试这38个circRNA/lncRNA。qRT-PCR结果显示8个lncRNA和8个circRNA具有良好的特异性和重复性。如图1D所示，与对照组相比，hsa_circ_0077232显示出高倍数变化。因此，我们选择了hsa_circ_0077232进行进一步分析（注意：本研究关注MiR-422a的ceRNA机制分子，为了获得分子，先用芯片/测序筛选差异表达的circ/lncRNA，而后软件预测，取可信度高的（超过两个结合位点），miRNA pulldown验证结合的分子。我们通常是先做测序筛选分子，而后预测结合的miRNA。本研究从相反角度寻找，思路新颖，值得学习。同时我们可以想像重要的miRNA极有可能通过ceRNA结合lnc/circ发挥作用的）。

    hsa_circ_0077232（circNT5E）位于染色体6中，长度为2,950个碱基对（bp），由来自NE5E基因组的7个外显子（外显子3-9）组成。Sanger测序证实circNT5E的RT-PCR产物中的头对尾剪接具有预期的大小（图1G）。用RNase R消化抗性证实该RNA种类是环状的（图1I）。FISH证明circNT5E优先定位于细胞质中（图1J）。

    我们使用FISH检测观察到随着临床分期的增加，circNT5E的表达水平显著增加，同时qRT-PCR测定显示，肿瘤组织中circNT5E表达显著高于正常组织。表明circNT5E在胶质瘤中起着致癌基因的作用。我们选择U87（circNT5E低表达）和U251（circNT5E高表达）细胞系进行分析。构建慢病毒载体circNT5E（LV-circNT5E），LV载体，LV-si-circNT5E和LV杂乱，建立稳定的转染子。qRT-PCR分析显示，在U87-circNT5E稳定细胞系中，circNT5E增加了99.04倍，而与对照细胞系相比，在U251-si-circNT5E稳定细胞系中circNT5E减少了77％。circNT5E的上调显著促进U87细胞的生长，增殖，侵袭和迁移，抑制细胞凋亡。同时circNT5E的敲低显著抑制U251细胞生长，增殖，侵袭和迁移并促进细胞凋亡。

    我们进一步研究了circNT5E对体内调节肿瘤生长的影响。与LV-载体组相比，在LV-circNT5E组中观察到肿瘤大小和重量增加。IHC染色显示，circNT5E增加了基质金属蛋白酶（MMP）-9和EGFR的表达。此外，与LV-scrambled组相比，在LV-si-circNT5E组中观察到肿瘤尺寸和重量减少。通过circNT5E敲低抑制MMP-9和EGFR。总之，结果证明circNT5E有效地促进体内GBM肿瘤形成。

    在许多先前的研究中已经鉴定出有助于circRNA生物发生的蛋白质因子，例如Quaking，RNA结合基序蛋白20和RNA编辑酶ADAR。然而，在GBM进展中导致circRNA生物发生的因素尚不清楚。我们专注于RNA结合蛋白，发现特定的富含脑的RNA编辑酶ADARB2在GBM组织中被下调（图5A）。在我们的临床样本实验中，发现GBM组织中的ADARB2 mRNA低于正常脑组织（图5B）。然而，出乎意料地，蛋白质印迹分析显示，GBM组织中ADARB2的蛋白质水平高于正常脑组织（图5C）。IHC结果还证实，ADARB2的蛋白质表达水平在肿瘤组织中高于ANT（图5D）。我们构建了ADARB2过表达质粒。结果显示，在具有ADARB2异位表达的U87细胞中，circNT5E的表达水平上调，而线性NT5E mRNA下调（图5G和H）。这些结果表明ADARB2参与GBM中circNT5E的生物合成。（注意：此处实验发现mRNA水平与蛋白质水平成相反的趋势，有时候发现mRNA与蛋白质表达不一致或许也是可以理解的）。

    我们确定在ceRNA筛选试验中可以通过生物素-miR-422a下调circNT5E。其次，我们搜索了circRNADB，这是一个带有蛋白质编码注释的人类环状RNA的综合数据库，没有发现circNT5E的结果。第三，circNT5E在GBM细胞的细胞质中丰富且稳定。基于这些发现，我们预测长度为2,950 bp的circNT5E可作为miRNA的结合平台，而不仅仅是miR-422a。正如TargetScan 6.2和PubMed搜索“miRNA [AND]胶质母细胞瘤”所预测的那样，我们发现20个与circNT5E相关的miRNA的结合位点（图6A）。几乎所有miRNA都是先前已描述的GBM相关肿瘤抑制剂。荧光素酶基因实验显示15种miRNA，特别是miR-422a，表现出下调的表达（图6B）。这些结果表明circNT5E直接结合miR-422a并抑制其活性。

    我们通过充当miR-422a的海绵进一步检查了circNT5E是否作为致癌基因起作用。构建过表达敲低细胞。结果表明，miR-422a逆转了circNT5E对细胞活力，增殖，侵袭和迁移的促进作用以及circNT5E对GBM细胞凋亡的抑制作用。基于这些结果，circNT5E至少部分地通过miR-422a影响GBM细胞的增殖，凋亡，侵袭和迁移能力。此外，我们通过蛋白质印迹分析验证了circNT5E/miR-422a调节轴对其下游信号传导通路的影响。结果表明，circNT5E在处理的GBM细胞中上调NT5E，SOX4，PI3KCA，p-Akt和p-Smad2水平，而circNT5E敲低下调NT5E，SOX4，PI3KCA，p-Akt和p-Smad2水平（注意：qPCR，WB验证那些基因？验证靶基因）。此外，我们还通过miR-124证实了circNT5E调节的CDK4和AURKA。总之，ADARB2蛋白过表达可逆转ADAR1诱导的circNT5E抑制，其通过调节miR-422a-NT5E，SOX4和PI3KCA信号传导通路影响GBM细胞的存活，增殖，迁移和侵袭。（注意：如何关联通路？验证通路重要的基因，基因变化了，通路就影响了）。

    本研究的主要发现如下：（1）我们确定了GBM肿瘤发生中的circRNA/lncRNA表达谱。（2）筛选显示miR-422a的海绵，circNT5E，其调节GBM细胞增殖，侵袭和迁移。（3）我们表征并功能评估了circNT5E是否由NT5E基因组形成并由RNA编辑酶ADARB2调节。（4）我们的研究结果表明，circNT5E通过海绵GBM抑制因子miRNA发挥额外的调节功能。总之，这些结果为开发GBM的新型治疗方法提供了见解。

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