Circular RNA VMA21 protects against intervertebral disc degeneration through targeting miR-200c and X linked inhibitor-of-apoptosis protein

环状RNA VMA21通过靶向miR-200c和X连锁的凋亡抑制蛋白来预防椎间盘退变

    期刊：ANN RHEUM DIS；影响因子：12.350

    发表单位：上海第九人民医院

    上一篇微文“从miRNA入手寻找ceRNA机制分子circ/lncRNA”，我们介绍了通过miRNA寻找重要circ/lncRNA形成ceRNA机制的思路。本研究同样从miRNA数据入手，下游预测其结合的基因XIAP，上游预测结合的circRNA形成ceRNA机制。纯生信预测是容易的，而如何从众多预测出来的分子中找到那个重要的分子的过程是艰辛的。

    通过对患者和大鼠模型的髓核（NP）细胞和退行性NP组织的进行的一系列实验发现了miR-200c通过抑制XIAP调节NP细胞活力和功能。circVMA21充当miR-200c的海绵，通过靶向miR-200c和XIAP在NP细胞中起作用。

    腰痛是一种常见疾病，也是全球残疾的主要原因，其主要发病原因是椎间盘（IVD）变性。椎间盘由内髓核（NP）组成，并由纤维环包围。多种异常刺激可增加NP中炎性细胞因子的水平，进而诱导NPC的合成代谢和分解代谢活性失衡，以及过度的NPC凋亡。这些不利因素引发或加速椎间盘退变（IVDD）。因此，有必要找到一种有效的方法来抑制NPC凋亡，减弱炎症反应，并逆转NP微环境中合成代谢和分解代谢之间的不平衡。

    使用从NCBI-GEO数据库（GSE45856）获得的微阵列数据研究退化NP组织中miRNA的差异表达。miRNA芯片数据发现在退行性NP组织中14个miRNA上调，miR-200c具有最高水平的上调（图1B），结果通过qRT-PCR测定、Northern印迹共同证实（图1D）。miR-200c过表达细胞（图1E）显示凋亡细胞百分比增加（图1F），胱天蛋白酶激活增加，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4和ADAMTS-5表达增加，以及胶原蛋白II和聚集蛋白聚糖表达减少（图1G）。表明miR-200c在NPC中具有促凋亡和促进代谢作用。IL-1β和TNF-α的治疗增加了NPC中的miR-200c水平，其可被miR-200c拮抗剂抑制（图1H）。敲低miR-200c，TNF-α和IL-1β的增强的细胞凋亡和细胞外基质（ECM）代谢反应的变化被显著抑制（图1I，J）。因此，功能丧失和功能获得实验支持miR-200c在负调节NPC存活和功能中的关键作用（注意：GEO已有芯片数据分析寻找重要的miRNA miR-200c，而后过表达证实功能。需要芯片/测序数据分析挖掘的可以联系我们）。

    基因本体论（GO）分析揭示了退行性NP组织中上调的miRNA与凋亡信号传导通路的调节之间的相关性。生信分析预测凋亡通路调节因子XIAP是miR-200c的靶基因。荧光素酶实验证实二者相互作用。与对照相比，在退行性NP组织中观察到XIAP表达的降低。升高的miR-200c水平降低了XIAP表达，而内源性miR-200c的敲低增加了NPC中的XIAP表达。XIAP敲低诱导NPC凋亡，加剧了分解代谢反应并降低了ECM组合物的表达。此外，缺乏XIAP显著抵消了miR-200c拮抗剂在用TNF-α和IL-1β处理的NPC中的作用，表明miR-200c通过XIAP发挥其功能（注意：生信分析预测miR-200c的靶基因，而后qPCR证实二者表达呈负相关，荧光素直接证实二者作用。需要预测miRNA/lnc/circ/mRNA之间靶标关系可以联系我们）。

    通过starBase预测与miR-200c结合的circRNA，根据clipreadNum分数筛选了前20个。通过qRT-PCR分析使用特异性引物检测NP样品中所选circRNA的存在。在NP组织中验证了circVMA21的预测剪接点。使用不同引物的扩增产物通过测序根据circVMA21的序列确认。通过qRT-PCR分析，与对照相比，退行性NP组织中的CircVMA21水平显著降低。该结果也通过RNA荧光原位杂交（FISH）证实。在退行性NP组织中，circVMA21水平与XIAP水平正相关。使用RNAhybrid将circVMA21的序列与miR-200c的序列进行比较，注意到circVMA21含有miR-200c的六个推定的靶位点。其中，通过荧光素酶测定验证了五个位点。与mRNA相比，该circRNA丰富且对RNase R处理具有抗性。Northern印迹分析显示线性VMA21可通过线性探针检测，但不能在剪接位点内检测到圆形探针。Pull down测定显示，与引入miR-200c突变相比，miR-200c捕获的级分中的circVMA21更富集。考虑到所有因素，我们的结果表明circVMA21能够直接结合NPC中的miR-200c。（注意：starBase 预测miR-200c结合的circRNA，RNAhybrid进一步分析结合位点）。

    NPC被携带circVMA21，线性VMA21，circVMA21 siRNA或对照siRNA的构建的腺病毒感染。qRT-PCR和Northern印迹分析证实circVMA21的敲低或过表达。circVMA21的上调增加XIAP的表达，而circVMA21敲低诱导XIAP表达的减少。circVMA21的上调抵消了miR-200c对XIAP表达和活性的抑制作用。表明circVMA21充当miR-200c的功能性海绵以调节XIAP表达和活性。此外，将circVMA21和XIAP siRNA共转染到NPC中，circVMA21对NPC活力和功能的积极作用减弱。（注意：将circRNA-miRNA-mRNA经典的通路机制联系起来）。

    通过针刺建立IVDD大鼠模型。在穿刺后1周和5周，使用33号细针将腺病毒人circVMA21注射到穿刺的IVD中。在第1,5和9周时获得的X射线显示在所有IVD穿刺组中随时间变化的进行性椎间隙变窄。在注射后9周，在circVMA21组中IVD的MRI变性得分显著低于非注射组。体内RNA FISH发现位于NP区域的circVMA21。注射腺病毒circVMA21后，退行性NP组织中circVMA21水平显著升高，而miR-200c水平降低。注射腺病毒circVMA21缓解了NP的退行性变化（注意：动物模型体内验证）。

    在这项研究中，我们首先将miR-200c鉴定为参与IVDD的关键miRNA。miR-200c参与了促凋亡反应和合成代谢因子和分解代谢因子的不平衡表达。然后，我们研究了circRNA对NPC中miR-200c调节功能的潜在影响。结果显示，circVMA21通过捕获并显著降低miR-200c的活性并抑制其功能。因此，提出了一种机制，其中circVMA21辅助miR-200c抑制NPC凋亡，促进ECM合成代谢并抑制ECM分解代谢，从而延缓IVDD的进展。

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