A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma

由环状LINC-PINT编码的肽抑制胶质母细胞瘤中的致癌转录延伸

    期刊：Nat Commun；影响因子：12.353

    发表单位：中山大学附属第一医院

    之前介绍了circRNA作为海绵吸附miRNA发挥作用，本研究发现circRNA序列中包含一个进化上高度保守的开放阅读框，通过内部核糖体插入位点序列IRES驱动翻译一个由87个氨基酸组成的肽。研究发现PINT87aa通过结合聚合酶相关因子复合物基因PAF1，抑制多种癌基因的转录延伸，进而抑制恶性胶质瘤的发生和进展。

    在这里，我们证明由长链非编码RNA产生的内源性circRNA编码调节肽。通过核糖体新生链复合物结合的RNA测序（RNC-seq），我们发现了几种可能由circRNA编码的肽。我们鉴定了由长基因间非蛋白质编码RNA p53诱导的转录物（LINC-PINT）的环形形式编码的87-氨基酸肽，其在体外和体内抑制胶质母细胞瘤增殖。

    迄今为止，circRNA通常被认为是非编码RNA（ncRNA）。然而，最近的证据表明功能性肽由ncRNA中的短开放阅读框（sORF）编码。另外，某些合成的circRNA是可翻译的，这提出了在哺乳动物细胞中含有sORF的天然circRNA是否被翻译成蛋白质或肽的问题。

    使用核糖体RNA耗尽的总RNA和来自正常人星形胶质细胞（NHA）和U251胶质母细胞瘤细胞的RNC-RNA来生成circRNAs（转录组测序）和RNC-RNAs（translatome测序）的RNA-seq数据库。通过测序并对差异表达的circRNA的宿主基因进行GO富集分析，并且该基因集富集用于GO分子功能，包括蛋白质结合和细胞成分组织。大多数circRNA与其宿主蛋白编码基因共享相同的CDS。共发现10个非编码宿主基因，其中5个具有编码潜能。初步筛选LINC-PINT进行进一步研究。LINC-PINT是一种抑制肿瘤的长基因间非编码RNA（lincRNA），参与Polycomb抑制复合物2（PRC2）。

    RNC-RNA组中有15个反拼接点特异性reads，而总RNA组中有7个reads，这意味着LINC-PINT的外显子2被鉴定为可翻译的环状RNA。LINC-PINT的长外显子2含有3'AG受体和反向剪接所需的5'GT供体序列，被鉴定为人CircBase中的circRNA（具有circ-0082389）。通过在逆转录后进行定量聚合酶链反应（q-PCR）和Sanger测序分析来自不同引物的PCR产物，以显示环状LINC-PINT外显子2的连接。然后用专门设计用于检测环状连接或线性连接的引物/探针进行Q-PCR和荧光原位杂交（FISH）分析，证实了人细胞系中LINC-PINT外显子2的头对尾拼接环形式的存在。LINC-PINT和circPINTexon2呈现不同的细胞定位：线性LINC-PINT主要定位于细胞核，而circPINTexon2主要是细胞质。

    我们首先分析了LINC-PINT外显子2中的所有潜在的sORF。我们鉴定了两个sORF，可能编码长度为69aa和87aa的肽，在这个外显子中，在多个物种中高度保守。并通过免疫荧光测试验证了编码87-aa肽的第二个sORF的表达。利用生物信息学分析和IRES活性测试证明了circPINTexon2含有天然内部核糖体进入位点（IRES）的活性。通过构建环状RNA表达质粒以及制备特异性抗体结合蛋白质谱证实环状RNA circ-PINT通过内部核糖体插入位点序列IRES驱动翻译一个由87个氨基酸组成的全新多肽PINT87aa。

    使用RFP融合蛋白标记，我们发现该肽集中在细胞核中。我们建立稳定过表达线性PINT87aa-GFP载体或环状circPINTexon2载体的456和4121细胞。另外，我们生成了CRISPR/Cas9诱导的PINT87aa K.O. SW1783和Hs683细胞。与相应的对照细胞相比，过表达线性PINT87aa和circPINTexon2的456和4121细胞均表现出G1停滞和细胞增殖减少而没有明显的细胞毒性，而PINT87aa K.O. SW1783和Hs683细胞显示出增加的细胞周期和细胞增殖速率。过表达线性和环状载体的456-PINT87aa和4121-PINT87aa细胞显示出显著的生长减少，而PINT87aa K.O. SW1783和Hs683细胞在平板菌落和软琼脂中显示增强的细胞增殖和恶性表型。基于上述结果，我们发现circPINTexon2通过PINT87aa代替circPINTexon2发挥其肿瘤抑制功能。

    使用抗Flag抗体对用PINT87aa-3XFlag转染的293T细胞和相应的对照细胞进行免疫沉淀。对沉淀物进行LC-MS/MS发现PINT87aa可能与PAF1蛋白复合物结合。通过分子模拟及coIP实验验证，发现了87aa可以和PAF1结合。此外，GFP-PINT87aa和PAF1共定位于细胞核中，表明PINT87aa可能参与PAF1靶基因调控。我们在PINT87aa过表达456和4121细胞中进行了进一步的实验，以确定PINT87aa是否参与PAF1靶基因延伸。与对照细胞相比，过表达PIN87aa的456和4121细胞中PAF1下游基因的mRNA被转录抑制。在PINT87aa K.O. Hs683和SW1783细胞，这些基因的表达在mRNA和蛋白质水平均增加。

    CircPINTexon2和PINT87aa在肿瘤相邻的正常脑组织中表达，但在所有脑肿瘤组织中表达降低，类似于LINC-PINT，其表达水平在乳腺癌，肝细胞癌和胃癌中亦是如此。在动物模型中，与对照细胞相比，在线性或环状质粒上稳定过表达PINT87aa的456和4121细胞表现出降低的原位致瘤潜力。此外，将Hs683和SW1783 PINT87aa K.O.细胞和对照细胞皮下注射到裸鼠中，随后用卡尺和体内荧光成像监测肿瘤生长。与其亲代细胞相比，PINT87aa K.O.细胞导致异种移植肿瘤体积显著增加，进一步支持PINT87aa肽在体内的抗癌作用。

    迄今为止，尚未报道由长ncRNA产生的编码circRNA。我们发现由circRNA编码的肽及其对人类恶性肿瘤的调节作用表明，circRNA可能发挥比先前预测的更多的生物学功能。circRNA编码的肽调节人类癌症行为，可能具有重要的临床意义和应用。此外，我们的结果提供了关于circRNA和长ncRNA的新观点，其生物学功能尚未显露。

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