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细胞样品

细胞样品       组织样品       血液样品       cell-free样品        RNA提取


        一、贴壁细胞的保存

       1、贴壁细胞培养诱导结束后,去除培养基,按照每 10cm2生长表面积加入 1ml Trizol 试剂,在旋涡震荡器上混匀直至看不见成团的细胞块,使之充分溶解于 Trizol 中形成清亮不粘稠的液体。
       2、放入干冰或-80℃冰箱中保存。


       二、悬浮细胞的保存

       1、悬浮细胞培养诱导结束后,将细胞悬液以 1200r/min 离心 5min,去除上清培养液。
       2、按照每 5×106 细胞加入 1ml Trizol 试剂,在旋涡震荡器上混匀直至看不见成团的细胞块,使之充分溶解于 Trizol 中形成清亮不粘稠的液体。
       3、放入干冰或-80℃冰箱中保存。



       三、RNA提取

       1、组织样品,每 100mg 组织加入 1ml Trizol,用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块)。细胞则根据其生长类型(贴壁、悬浮)加入相应量的 Trizol。
       2、每 1ml 用于抽提的 Trizol 加入 200μl 的氯仿,上下颠倒充分混匀 1min 左右,室温静置 5 min。
       3、 4℃, 12,000rpm 离心 15 min。 (optional)总 RNA 的纯化( RNeasy Kit)通常在使用 Trizol 法抽提组织总 RNA时,因为方法的限制,造成总 RNA 的纯度降低。所以建议使用 QIAGEN RNeasy Kit 进一步的纯化。
       4、取总 RNA≤100μg 溶解于 100μl RNase-free 的水中,再加入 350μl Buffer RLT 并充分混匀。
       5、加入 250μl 无水乙醇, Tip 头充分混匀。
       7、吸取 500μl Buffer RPE 到 RNeasy mini 柱子内,≥8000g 离心洗涤 15-30sec,弃去滤过液,再用 500μl Buffer RPE在≥8000g 离心洗涤 2min,弃去滤过液和 2ml 的套管,将 RNeasy mini 柱子转入一新的 1.5 ml Eppendorf 管中。
       8、吸取 40 μlRNase free 的水,≥8000g 离心洗脱 1 min。
       9、重复步骤 5 一次。
       10、测定 OD 值(通常 OD 数值在 1.8-2.1 之间),并做进一步的 RNA 质量检测。



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